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1、12蛋白質(zhì)分子的化學修飾要點第一節(jié)酶的活性中心第二節(jié)酶化學修飾的目的第三節(jié)酶化學修飾的原理第四節(jié)酶化學修飾的設計第五節(jié)酶化學修飾的應用第六節(jié)酶的蛋白質(zhì)工程第一節(jié)酶的活性中心（activesite）一、活性中心的概念酶的必需基團(essentialgroup):與酶活性有關(guān)的基團酶的活性中心(activecenter):由必需基團構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域.活性部位只占酶分子很小的一部分胰凝乳蛋白酶活性部位是一個三維實體二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個三維實體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。(4)活性中心構(gòu)象不
2、是固定不變的（誘導契合）。(5)酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。酶的穩(wěn)定性1.酶穩(wěn)定的分子原因1）共價鍵：肽鍵（peptidebond）——穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。二硫鍵（disulfidebond）——由兩個Cys的側(cè)鏈-SH氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。2）非共價鍵：疏水相互作用（hydrophobicinteraction）:是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。氫鍵（hydrogenbond）：是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級結(jié)構(gòu)的重要力量。靜電相互作用（electrostaticinteraction）：又稱離子鍵、鹽鍵、
3、鹽橋，是正負電荷間的作用力。對酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成于分子表面上。范德華力：在電中性分子之間的非共價結(jié)合。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。金屬離子：Ca2+、Mg2+和Zn2+等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。途徑方法優(yōu)點不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復雜，周期長蛋白質(zhì)水平化學修飾適應所有酶，操作簡單經(jīng)濟修飾過程破壞酶分子劑型固定化適應所有酶，穩(wěn)定性高，可重復利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良穩(wěn)定劑簡單、經(jīng)濟工作量大反應介質(zhì)適用于特殊反應體系和酶類適合的酶類還不
4、普遍2.穩(wěn)定酶的方法三、研究酶活性中心的方法1.物理學方法：用X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復合物（包括酶和底物）的相對位置。2.化學修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分為1)非專一性化學修飾用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團作用。若某基團被修飾后：酶活性不變——該基團可能不是酶的必需基團酶活性降低或喪失——該基團可能是酶的必需基團但不能確定化學試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團結(jié)合?；钚灾行幕鶊F的鑒定標準①失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。②S或可逆抑制劑有保護作用（活性中心）。先加S或競Ⅰ加共價修飾劑透析除去S或競Ⅰ活性不喪失差別標記：底物或抑制劑存在活性基團不與修飾
5、劑作用去除底物或抑制劑原來被保護的基團帶同位素標記可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團?；瘜W修飾含同位素標記的同樣試劑2)專一性化學修飾（基團專一性修飾）用專一性化學修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團。3)親和標記（位點專一性修飾）采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學結(jié)構(gòu)設計合成的含有活潑反應基團的底物類似物。作用機制：利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標記?；瘜W修飾的專一性親和修飾劑：①與S結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基親和力大，而與活性中心以外的氨基酸殘基親和力小。②具有活潑的化學基團（如鹵素）可與活性中心的基團形成穩(wěn)定的共價鍵。3.蛋白質(zhì)工程：將酶相應的cDNA定點
6、突變，突變的cDNA只表達一個或幾個氨基酸被置換的酶蛋白，測定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需。第二節(jié)酶化學修飾及修飾目的一、酶化學修飾1.限制酶大規(guī)模應用的原因：酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，日益增多的酶制劑已用于食品發(fā)酵、疾病診治和預防、環(huán)境保護和監(jiān)測、化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，以及基因工程等生物技術(shù)領(lǐng)域。但是酶在實際應用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應和被識別降解(具有抗原性)；2、酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機溶劑及時間的考驗，半衰期短、易變性失活(細胞外穩(wěn)定性差)；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應生產(chǎn)工
7、藝要求，限制了酶制劑的應用范圍(酶活性不夠高)。2.改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的。3.酶化學修飾的概念（原理、方法、應用）酶的化學修飾（chemicalmodification）：通過化學基團的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性
