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1、人參皂苷CK抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用探究 [摘要]目的觀察人參皂苷CK的抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法①?gòu)?fù)制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠敗血癥模型，觀察人參皂苷CK對(duì)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞變化及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的影響；②復(fù)制大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察人參皂苷CK對(duì)腦梗死灶體積百分比和小膠質(zhì)細(xì)胞變化的影響；③原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察人參皂苷CK對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞激活及培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量變化的影響。結(jié)果①模型對(duì)照組腦內(nèi)TNF-α[（198.38±12.84）mg/L]和IL-1β[（845.15±41.
2、97）ng/L]含量明顯高于正常對(duì)照組[（106.71±11.21）mg/L、（477.46±49.76）ng/L]，陽性對(duì)照組[（141.46±11.91）mg/L、（690.94±54.71）ng/L]和人參皂苷CK低[（157.23±12.25）mg/L、（726.04±64.29）ng/L]、中[（136.58±13.17）mg/L、（651.88±55.65）ng/L]、高[（121.33±12.09）mg/L、（577.36±51.86）ng/L]劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 1.3.2人參皂苷CK對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響1.3.2.1分組、給藥及造模8SD大
3、鼠70只，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、人參皂苷CK低、中、高劑量組（10、20、40mg/kg），每組14只。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水，人參皂苷CK低、中、高劑量組分別給予人參皂苷CK10、20、40mg/kg，腹腔注射，0.2mL/100g，連續(xù)給藥7d，末次給藥后30min，參照Longa等[8]的方法，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型。簡(jiǎn)述如下：大鼠麻醉后固定，分離并結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈根部，夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，距分叉約10mm處剪口插入頭端膨大的尼龍魚線約18mm。假手術(shù)
4、組僅分離頸總及頸外動(dòng)脈，不插線。選擇蘇醒后行走向右旋轉(zhuǎn)或右側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。缺血3h后行再灌注。1.3.2.2指標(biāo)測(cè)定各組動(dòng)物在缺血再灌注72h后處死，取腦，快速脫水，低溫石蠟包埋，冠狀組織切片（厚度約30μm，間隔600μm），分別做紅四氮唑（TTC）染色和小膠質(zhì)細(xì)胞凝集素標(biāo)記染色。TTC染色：將切片置于TTC溶液中37℃孵育30min，正常腦組織被染為紅色，梗死灶呈白色，用病理圖像分析系統(tǒng)（BN-TW-5001）分析，計(jì)算梗死灶體積值和缺血側(cè)半球體積值并計(jì)算梗死體積百分比[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞凝集素標(biāo)記染色方法同“1.3.1.2”項(xiàng)下。1.3.3人參皂苷CK對(duì)
5、LPS激活原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響1.3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)8小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)參照Park等[10]方法進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：新生SD大鼠1只（2d）麻醉后處死，取腦，分離大腦皮層并消化，細(xì)胞懸液過濾后加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）終止消化，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸后靜置30min，取細(xì)胞懸液接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3h后換液，以后每2天換液1次，顯微鏡下觀察到出現(xiàn)細(xì)胞分層現(xiàn)象后，吸棄培養(yǎng)液，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液3∶1稀釋的胰蛋白
6、酶（25%）消化25～40min，將含有懸浮的小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后更換DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞純度>95%后開始實(shí)驗(yàn)。1.3.3.2指標(biāo)測(cè)定①細(xì)胞形態(tài)觀察：細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中（5×104個(gè)/孔），分為正常對(duì)照組、LPS組和人參皂苷CK低、中、高劑量組（20、40、80mmol/L）。細(xì)胞培養(yǎng)16h后加入人參皂苷CK（以DMEM/F12完全培養(yǎng)基配制，正常對(duì)照組和LPS組加入等體積培養(yǎng)基）培養(yǎng)24h，再加入LPS（1mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)24h，40g/L多聚甲醛固定10min，凝集素標(biāo)記染色（方法同“1.3.1.2”項(xiàng)下），
7、倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。②培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量測(cè)定：細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板（3×106個(gè)/孔），培養(yǎng)168h后，分組與藥物處理方法同上。處理到預(yù)定時(shí)間后，吸取培養(yǎng)上清液100μL加入96孔板，加入等體積Griess試劑（5%磷酸配制1%磺胺，蒸餾水配制0.1%鹽酸萘乙二胺，臨用前等體積混合）混勻，室溫避光靜置10min，酶標(biāo)儀測(cè)540nm吸光度值，亞硝酸鈉繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中NO的量，平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值。③細(xì)胞內(nèi)ROS含量測(cè)定：細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板（6×1
