外泌體提取方法總結

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1、細胞培養(yǎng)上清:即在4℃下,首先300×g離心10min，吸取上清液,然后2000×g離心10min;吸取上清液后,10000×g高速離心30min，吸取上清液;140000×g超速離心90min;除去上清液,所獲得的沉淀即為外泌體。用PBS緩沖液洗滌沉淀并重懸后，140000×g再次離心90min,100μLPBS緩沖液重懸沉淀，凍存于—80℃?zhèn)溆谩?、將小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝結1小時而不進行抗凝。此后，將其以2，000×g離心持續(xù)10分鐘獲得血清。接著將血清以3，000×g離心10分鐘。將上清液以無菌PBS以1：1的比例稀釋并離心再次以10,000×g保持30分鐘,然后以200，000×g進行2小時超速離心。將顆粒在a中洗滌大量PBS,通過0.2—μm注射器過濾器過濾,并以200，000×g離心1小時，然后收集沉淀并重懸于PBS或PBS中用于后期功能或生化測定的培養(yǎng)基。為了從體液（例如尿液，支氣管肺泡灌洗液,血清,血漿,腫瘤腹水）中純化外泌體,只需通過常規(guī)方法收集液體即可.血漿用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的話不抗凝直接離心.在4°C下在玻璃瓶中儲存長達5天，直至進行外泌體純化。外泌體純化的原理與從組織培養(yǎng)條件培養(yǎng)基開始時的原理相同，但由于某些流體的粘度,必須稀釋它們，并增加離心的速度和長度.該方案已在作者的實驗室中用于從人血漿中純化外泌體（

1Caby等，2005)。基本方案1中指出的所有預處理也適用于該方案。材料液體（例如，血漿：通過Ficoll離心與血細胞分離；淋巴，血清，尿液，細支氣管灌洗或腫瘤腹水）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS;附錄）2A）冷凍離心機50毫升聚丙烯離心管0。22微米過濾裝置（如Steritop,Millipore）超速離心機和固定角度或擺動式轉子（見表3。22。1）適用于超速離心機轉子的聚合物管或聚碳酸酯瓶(見表3.22）0.1）注意：所有離心均應在4℃下進行。1.用等體積的PBS稀釋液體。將稀釋的液體轉移到50毫升管中。在2，000×g，4℃下離心30分鐘。2。將上清液轉移到超速離心管或瓶中,沒有顆粒污染（參見基本方案1,步驟3注釋）。在12，000×g，4℃下離心45分鐘。3。小心地將上清液轉移到超速離心管或瓶中（根據(jù)處理的液體體積，可參見表3。22.1中的管）。在110,000×g，4℃下離心2小時.4。將沉淀重懸于1mlPBS中,并將其在其中一個管中匯集.用PBS填充管以大量稀釋再懸浮液。5.通過0。22-μm過濾器過濾懸浮液，并收集在新鮮的超速離心管或瓶中。6。在110，000×g，4℃下離心70分鐘。倒出上清液。7.將沉淀重懸于1mlPBS中,然后用PBS填充管。在110，000×g，4℃下離心70分鐘。倒出上清液。8。將沉淀重懸于50至200μlPBS中。在—80℃下儲存長達1年。