鼻咽癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的提取和鑒定_黃雪琴

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1、廣東醫(yī)學(xué)2016年1月第37卷第2期GuangdongMedicalJournalJan．2016，Vol．37，No．2·191·*鼻咽癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的提取和鑒定12111△黃雪琴，崔仲宜，蔣東輝，張?jiān)嘛w，羅國(guó)慶12廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(廣東湛江524001);廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所(廣東湛江524023)【摘要】目的從鼻咽癌細(xì)胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1中分離外泌體，并對(duì)CNE－2所得外泌體進(jìn)行鑒定。方法使用ExoQuick－TC(SBI)試劑盒法從鼻咽癌細(xì)胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1培養(yǎng)上清液分離

2、出外泌體，使用透射電鏡觀察其形態(tài)特征，BCA法進(jìn)行蛋白定量，Westernblot進(jìn)行外泌體特異性抗原分子CD63及筏蛋白－1鑒定。結(jié)果3種鼻咽癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清液中均分離出大量泡狀物，透射電鏡下觀察呈圓形的囊泡，直徑為40～130nm，具有完整胞膜。且CNE－2來(lái)源的此種泡狀物表達(dá)外泌體特異性膜筏蛋白－1、CD63。10mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE－2培養(yǎng)上清液得到487μg/mL(以蛋白計(jì))的外泌體200μL。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)室保存的3種鼻咽癌細(xì)胞系很可能均能產(chǎn)生外泌體，ExoQuick－TC(SBI)法能夠簡(jiǎn)便快速地從鼻咽癌細(xì)胞系中提取到外泌體，不需要超速離心

3、，為鼻咽癌的防治研究提供了新的研究方法和靶點(diǎn)?！娟P(guān)鍵詞】鼻咽癌細(xì)胞;外泌體;分離;鑒定DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.20160131.013鼻咽癌是位于頭頸部的上皮細(xì)胞源性惡性腫瘤，Ｒad)。GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio－Ｒad)、Bio－惡性程度高，診療困難，病死率高，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。ＲadiMark酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio－Ｒad)、HitachiCＲ22GⅢ鼻咽癌好發(fā)于非洲北部、東南亞以及中國(guó)南方各省，尤高速冷凍離心機(jī)(日本日立)、JEOL/JEM－1400透射其是廣東省。放療或放化療聯(lián)合是早期鼻咽癌的主要電鏡(日本電子)

4、、Eppendorf5417Ｒ臺(tái)式冷凍離心機(jī)治療方案。放療及綜合化療策略的改進(jìn)改善了初期鼻(德國(guó)艾本德)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab)。［1］咽癌患者的預(yù)后。但是，15%～58%的鼻咽癌患者1．2方法［2］會(huì)復(fù)發(fā)并遭受二次治療。因而，鼻咽癌的復(fù)發(fā)成為1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)液氮罐內(nèi)取出凍存的細(xì)胞，42℃水臨床醫(yī)生最為棘手的問(wèn)題。傳統(tǒng)的治療只能有限地局中快速輕搖解凍。含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉部控制及部分改善生活質(zhì)量，更重要的是這些療法通素－鏈霉素溶液，碧云天，海門(mén))的ＲPMI1640細(xì)胞完常會(huì)誘導(dǎo)嚴(yán)重的晚期并發(fā)癥，采取綜合治療就顯得尤全培養(yǎng)液重懸

5、，1000r/min離心5mim，棄上清液，新2為必要。免疫治療作為有效的新型療法之一，其關(guān)鍵鮮完全培養(yǎng)基重懸后接種到60cm的培養(yǎng)皿中，置是尋找腫瘤特異性抗原。外泌體(exosome)由John-5%CO、飽和濕度的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生2［3］stone等首次從網(wǎng)織紅細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)和命名。隨長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底板面積的95%左右，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2［4－6］后更多學(xué)者證實(shí)多種細(xì)胞均可分泌外泌體，對(duì)其次，胰酶消化液消化，等體積完全培養(yǎng)液終止消化，1000產(chǎn)生、組成及功能的研究逐步深入。2014年8月至r/min離心5min，棄上清液，新鮮完全培

6、養(yǎng)基重懸細(xì)胞，2015年7月，本研究從鼻咽癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清液中提1∶3比例進(jìn)行傳代，均使用60cm2培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生取外泌體，為研究鼻咽癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移機(jī)制及免疫治療長(zhǎng)期，確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，準(zhǔn)備用于外泌體提取。提供新的切入點(diǎn)。1．2．2收集條件培養(yǎng)基上述傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞，長(zhǎng)至1材料與方法培養(yǎng)皿底板面積的60%左右，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，1．1材料與設(shè)備鼻咽癌細(xì)胞系高分化株CNE－1、加入新的不含血清的ＲPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24低分化株CNE－2及EB病毒基因攜帶株SUNE－1(本h后收集條件培養(yǎng)基10mL，離心棄沉淀后，使用0.22實(shí)

7、驗(yàn)室凍存)、ＲPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO)、μm微孔濾膜(美國(guó)Millipore)過(guò)濾2次，4℃保存1周，胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(海門(mén)碧云天)、－20℃長(zhǎng)期保存。BCA法蛋白測(cè)定試劑盒(海門(mén)碧云天)、ExoQuick－TC1．2．3外泌體的提取細(xì)胞條件培養(yǎng)液10mL，4℃外泌體提取試劑盒(美國(guó)SBI)、兔抗－CD63(美國(guó)Ab-3000g離心15min去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片;將上清液轉(zhuǎn)cam)、兔抗－筏蛋白－1(Flotillin－1)(美國(guó)Abcam)、移至無(wú)菌管中，加入2mL的ExoQuick－TC沉淀液，反羊抗兔二抗(美國(guó)A

8、bcam)、ECL發(fā)光液(美國(guó)Bio－復(fù)顛倒3次使其混勻;冷藏(4℃)過(guò)夜(12h);10000g離心Exo