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第三節(jié)細胞核移植
1細胞核移植:是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵母細胞內(nèi)的技術(shù)。供體細胞受體細胞重構(gòu)胚動物克隆:不經(jīng)過有性生殖過程,通過細胞核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體相同動物個體的技術(shù),叫做動物克隆。供體細胞受體細胞重組胚重組胚激活與培養(yǎng)胚胎移植后代鑒定
2一細胞核移植發(fā)展歷程兩棲類細胞核移植魚類的核移植哺乳類的細胞核移植
31兩棲類細胞核移植1938年Spemann最先提出將多細胞胚胎的每一個細胞核移植到去掉核的卵母細胞中,使它們重新發(fā)育成胚胎的設(shè)想。1952年,Briggs和King沿用Spemann的思路和實驗技術(shù),首次獲得兩棲動物美洲豹蛙胚胎細胞核移植的后代.
41958年到1962年,英國劍橋大學的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細胞核移植,培育出可育的非洲爪蟾.1974年JohnGurdon以同樣的方法,用青蛙腳蹼角質(zhì)化細胞進行移核試驗,蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。
52魚類的核移植從1961年開始,童第周等以金魚和鳑鮍魚為材料,進行魚類不同亞科間的細胞核移植獲得成功,用以研究雜交細胞核與純種細胞核在發(fā)育功能上的差異,以及細胞質(zhì)對細胞核的影響.
61979年,中國科學院武漢水生物研究所利用鯽魚做移核試驗。他們把鯽魚囊胚期細胞經(jīng)過385天59代連續(xù)傳代培養(yǎng)后,再將此種培養(yǎng)細胞的細胞核移植到同種鯽魚的未受精卵中。到1980年4月,他們成功地培育了兩尾無性繁殖的幼魚,其中一條發(fā)育正常。
71989年,童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細胞核移入鯉魚去核的未受精卵中,實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交,成功地無性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。
83哺乳類的細胞核移植1977年,美國緬因州巴爾港的杰克遜實驗室用“亞無性繁殖”的方式,培育出7只單親小鼠。
9將卵細胞受精,在精、卵核融合之前,把精核去掉,然后放入加有適量細胞松馳B的溶液中。經(jīng)此番處理的卵細胞的染色體復制后出現(xiàn)了兩個核,將此雙核細胞放入正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。卵中的雙核細胞自動融合,并且細胞開始分裂。將此種胚胎移入母鼠子宮培育。生產(chǎn)出7只單親小鼠。
101981年,瑞士日內(nèi)瓦大學和美國杰克遜實驗室合作,首次對小鼠卵進行移核試驗獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細胞團細胞的核移入去核的受精卵中,經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育至囊胚期,再將此胚胎移入同步孕鼠子宮內(nèi),最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠,并發(fā)育成了可育的個體。
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12多莉和威爾穆特
13二細胞核移植克隆動物的技術(shù)路線核供體細胞和獲得與取核受體細胞的準備與去核細胞核移植重組胚的激活與培養(yǎng)胚胎移植核移植后代鑒定
141核供體細胞獲得與取核細胞來源:胚胎細胞,干細胞,體細胞細胞類型:成纖維細胞,上皮細胞細胞周期時相:G0/G1細胞傳代數(shù)供體年齡取核
152受體細胞的準備與去核減數(shù)分裂Ⅱ期成熟卵母細胞卵母細胞去核方法盲吸去核法:細胞松弛素熒光染料Hoechst33342功能性去核法:用紫外線或激光照射使染色體失活;化學誘導去核法:脫羰秋水仙堿
163細胞核移植胞質(zhì)內(nèi)直接注射法透明帶下注射法
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214重組胚的激活電激活:電脈沖次數(shù)、時間、間隔;化學激活:7%乙醇,離子霉素,鈣離子載體。
225重組胚培養(yǎng)和移植6體細胞核移植后代的鑒定
23三胚胎細胞核移植克隆動物四體細胞克隆動物
24五影響核移植動物成功率的因素核供體卵母細胞去核卵母細胞的成熟程度及其激活能力核質(zhì)相互作用與細胞周期同步化重組胚的培養(yǎng)及發(fā)育
25六克隆技術(shù)的應用前景:培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實驗動物;生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物;生產(chǎn)人胚胎干細胞用于細胞和組織替代療法;復制瀕危的動物物種,保存和傳播動物物種資源。
26七克隆技術(shù)存在的問題理論問題分化的體細胞克隆對遺傳物質(zhì)重編的機理還不清楚;克隆動物是否會記住供體細胞的年齡;克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因;在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。
27實踐問題克隆動物的成功率還很低;生出的部分個體表現(xiàn)出生理或免疫缺限;即使是正常發(fā)育的“多莉”,也被發(fā)現(xiàn)有早衰跡象;對倫理道德的沖擊。