土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定和淀粉酶活測(cè)定

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1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測(cè)定摘要：從飯?zhí)瞄T(mén)口和生化樓樓下的土壤中分離、純化、培養(yǎng)獲得七個(gè)菌株，其中五個(gè)為能分泌淀粉的芽孢桿菌，通過(guò)一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)其中兩個(gè)菌株的種屬進(jìn)行了初步鑒定，并對(duì)其中一株菌所產(chǎn)的淀粉酶活力進(jìn)行了測(cè)定。關(guān)鍵字：土壤芽孢桿菌淀粉酶鑒定活力土壤微生物類(lèi)群在全球自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用,它推動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán),維持生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和氣候等綜合因素對(duì)微生物的影響和作用,同時(shí)其生命活

2、動(dòng)也反映出土壤肥力、土壤改良與植物營(yíng)養(yǎng)的密切關(guān)系。芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的部分之一,也是土壤細(xì)菌的主要種群之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小組合作，由老師指導(dǎo)，小組自行設(shè)計(jì)、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)土壤微生物進(jìn)行分離、純化及鑒定，發(fā)酵及產(chǎn)物測(cè)定，對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行一個(gè)比較全方面的鍛煉和培養(yǎng)。（1）了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用方法和技術(shù)；（2）掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；（3）掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理及方法；（4）培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析解決問(wèn)題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能

3、力；（5）對(duì)所學(xué)習(xí)過(guò)的微生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練；（6）從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較各產(chǎn)淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的分布情況。1.原理及方法概述1.1原理1.1.1芽孢桿菌1.1.1.1形態(tài)學(xué)特性：芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。1.1.1.2生理學(xué)特性：芽孢桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性，嚴(yán)格需

4、氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。多數(shù)為腐生菌,主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。該屬細(xì)菌的重要生理特性是能夠產(chǎn)生對(duì)對(duì)熱、pH和鹽各種多樣性的不利條件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。發(fā)現(xiàn)于不同的生境，少數(shù)種對(duì)脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物致病。）1.1.2淀粉酶淀粉酶是催化淀粉水解的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。目前生產(chǎn)應(yīng)用的淀粉酶主要來(lái)源于微生物，并集中在幾種細(xì)菌和真菌中，尤其以芽孢桿菌所產(chǎn)的淀粉酶較多。其原因首先芽孢桿菌屬中能產(chǎn)生淀粉酶的菌種較多；其次，芽孢桿菌屬產(chǎn)的淀粉酶有較好的應(yīng)用價(jià)值

5、。土壤中可利用的微生物很多，因此從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，分離純化，并進(jìn)行酶活測(cè)定，能獲得有經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的菌株。1.1.4生理生化鑒定由于各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，所以它們能利用的底物（如糖、醇及各種含氮物質(zhì)等）不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不相同，因此可利用各種生理生化反應(yīng)來(lái)鑒別不同的細(xì)菌。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，在芽孢桿菌屬中，我們鑒定用的生理生化實(shí)驗(yàn)有：（1）革蘭氏染色試驗(yàn)（2）芽孢染色試驗(yàn)(3)淀粉水解試驗(yàn)（4）吲哚試驗(yàn)（5）VP試驗(yàn)（6）細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉

6、伯糖、甘露醇）（7）耐鹽試驗(yàn)（8）溫度實(shí)驗(yàn)（9）PH試驗(yàn)(10)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)(11)硝酸鹽還原試驗(yàn)(12)明膠液化試驗(yàn)(13)酪氨酸水解試驗(yàn)(14)酪素水解試驗(yàn)(15)運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)（鞭毛穿刺試驗(yàn)）(16)接觸酶試驗(yàn)(17)溶菌酶試驗(yàn)(18)卵磷脂試驗(yàn)(19)馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn)（不做）（20）苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)（不做）（21）精氨酸水解實(shí)驗(yàn)（不做）1.2方法1.2.1分離純化方法從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。由于芽孢具有較強(qiáng)抗熱能力，分離純化時(shí)可采用熱處理的方法，高溫加

7、熱處理，殺死樣品中所有不含芽孢的菌類(lèi)，在培養(yǎng)過(guò)程中得到很好的富集。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落

8、并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。1.2.2單染色用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美藍(lán)、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅