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《實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米mir604》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604常麗娟宋君張富麗劉文娟唐春燕王東尹全川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心轉(zhuǎn)棊因玉米MIR604是瑞士先正達(dá)公司2005年研發(fā)的抗蟲玉米，屮國(guó)于2008年批準(zhǔn)MIR604進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。為了精確定量檢測(cè)MIR604及其加工產(chǎn)品，在M1R604的左側(cè)邊界序列和玉米基因組之間設(shè)計(jì)引物和探針，成功建立了MIR604品系特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。采用該方法設(shè)計(jì)的引物和探針，對(duì)6種非轉(zhuǎn)基因作物、MTR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)，除MTR604外，其余樣品均未檢測(cè)到MIR604分子片段的擴(kuò)增信號(hào);對(duì)已知含量為1
2、%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)量值為1.07%，接近真實(shí)值靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能檢測(cè)到僅5個(gè)拷貝的M1R604分子片段。該試驗(yàn)所建立的M1R604品系特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法只有較高的特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度，可用于轉(zhuǎn)基因玉米MTR604的定量檢測(cè)。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米M1R604;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;特異性;準(zhǔn)確度;靈敏度;James等U1調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球有超過(guò)120個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品種在二十多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)可作為食品和飼料的加工原料。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌Cry3A基因的抗蟲玉米，由該基因編碼的毒素蛋白由3個(gè)不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域組成，對(duì)鞘
3、翅目昆蟲具有特異毒性U1。自2007年起，M1R604先后在美國(guó)、菲律賓、俄羅斯、韓國(guó)和円本等多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)可進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。我國(guó)于2008年批準(zhǔn)MIR604進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。MIR604進(jìn)入中W市場(chǎng)后，按照我W轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理辦法規(guī)定，MIR604及其加工產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。目前，我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)體系中只有MTR604及其加工產(chǎn)品的定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)m，尚無(wú)相關(guān)的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際上歐盟曾經(jīng)發(fā)布過(guò)棊于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)￡41，但國(guó)內(nèi)尚未對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確證。為了精確定量M1R604,本試驗(yàn)逑立了M1R604品系特異實(shí)時(shí)
4、熒光定量PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因玉米安全監(jiān)管提供理論支持。1材料與方法1.1材料1.1.1植物材料實(shí)驗(yàn)所用的含量為W和10%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CertifiedReferenceMaterial,CRM)及其他轉(zhuǎn)基因作物粉末材料均購(gòu)自歐盟聯(lián)合研宄中心測(cè)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研宄所(IRRM,InstituteforReferenceMaterialsandMeasurements,JointResearchCentre(JRC),Belgium);實(shí)驗(yàn)所用的非轉(zhuǎn)基因作物材料由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所用的植物基因組DNA純化試劑和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試
5、劑(RealTimePolymeraseChainReaction(PCR)MasterMix),購(gòu)自TIAN-GEN天根生化科技(北京)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器有超微量分光光度計(jì)(Nanodrop1000,ThermoFisherScientificCorporation)和實(shí)時(shí)焚光PCR系統(tǒng)(RealTimePCRSystem7500,AppliedBiosystemCorporation,USA)o1.2方法1.2.1DNA的分離與純化按照植物基因組DNA純化試劑盒(TTAN-GRN,天根生化科技(北京)有限公司)說(shuō)明書分離、純化基因組DNA。1.2.2
6、引物和探針設(shè)計(jì)玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSlIb采用M家標(biāo)準(zhǔn)GB19495.4—2004中的引物和探針序列邊1,通過(guò)查詢MIR604的載體和旁側(cè)序列信息(.shgmo.org/welcome.htm)，應(yīng)用PrimerExpress3.0在左側(cè)邊界序列和玉米棊因組連接處設(shè)計(jì)定量PCR引物和探針，所有引物與探針均由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.3反應(yīng)體系及條件將DNA稀釋到50ng?uL,取4uLDNA加入到20uL反應(yīng)體系:TaqManMastermix（2X）10yL,上下游引物（lOumol.L）各1yL,探針（lOumol.L）0.5uL,補(bǔ)水至20uL。運(yùn)行
7、如下程序:95°C預(yù)變性10idn,1個(gè)循環(huán);95"C變性15s,60°C退火60s,45個(gè)循環(huán)。1.2.4方法的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度采用本方法對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米59122、DAS-40278-9、3272、Mon863、Mon810、Mon88017、Btll、Btl76、NK603、TC1507、T25、GA21、MIR162、MIR604、98140,5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、科豐2號(hào)、科豐6號(hào)、克螟稻5、M12,5個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、Mon87701、Mon87708、A5547-127、A27
8、04-12
