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《觀察大鼠腦神經(jīng)元c-fos蛋白表達(dá)的方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)46觀察大鼠腦神經(jīng)元c-Fos蛋白表達(dá)的方法【目的要求】1.學(xué)會(huì)用免疫組織化學(xué)技術(shù)顯示腦神經(jīng)元中c-Fos蛋白表達(dá)的方法。2.了解腦內(nèi)神經(jīng)元c-Fos蛋白表達(dá)的特點(diǎn)?！净驹怼縞-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白?；A(chǔ)狀態(tài)下，c-Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的水平非常低，然而各種應(yīng)激狀態(tài)下，c-Fos蛋白的表達(dá)能夠被瞬時(shí)快速地誘導(dǎo)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)c-Fos蛋白的表達(dá)依賴于應(yīng)激源的內(nèi)在特性、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。由于c-Fos蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)能在很大程度上反映應(yīng)激誘導(dǎo)
2、的神經(jīng)元活動(dòng)情況，故其常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志，并廣泛用于示蹤特定條件下的神經(jīng)功能通路。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫學(xué)抗體與抗原特異性結(jié)合的原理識(shí)別c-Fos蛋白，并通過與抗體相聯(lián)接的酶催化底物改變顏色使之顯示出來，從而對其進(jìn)行定位和半定量研究。大鼠不同腦區(qū)c-Fos蛋白的表達(dá)程度反映了神經(jīng)元激活的空間模式?！静牧吓c器械】大白鼠、常用手術(shù)器械、冰凍切片機(jī)、顯微鏡、24孔或48孔培養(yǎng)板或稱量瓶（25×30）、移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）、移液器槍頭（10μL、200μL、1000μL）
3、、滴管、粘片劑處理的載玻片、蓋玻片、小毛筆、染色缸、2%戊巴比妥鈉、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PB，pH7.4）、0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS，pH7.4）、4％多聚甲醛（0.1mol/LPB配制）、20%蔗糖（0.1mol/LPB配制）、防凍液（丙三醇：乙二醇：PBS=2：3：5）、OCT包埋劑、3%過氧化氫/甲醇溶液、10%正常羊血清或牛血清白蛋白、30%TritonX-100、兔抗大鼠c-Fos抗體、生物素化羊抗兔IgG、鏈親和素辣根過氧化物酶復(fù)合物、DAB顯色液、May
4、er’s蘇木精染液、梯度酒精（75%、95%、100%）、二甲苯、中性樹膠?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1.麻醉大鼠2%戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。2.腦組織的固定及脫水處理左心室穿刺至主動(dòng)脈升部，先灌流0.01mol/LPBS約200mL，快速?zèng)_洗血液，隨后灌注冷的4％多聚甲醛約400mL，先快后慢，持續(xù)約1h。取腦后，將其置于4%多聚甲醛（4℃）后固定4～6h，或儲(chǔ)存過夜。然后將腦組織置于20%蔗糖（4℃）中脫水，至腦沉底。若要較長時(shí)間保存腦組織，脫水后，放入防凍液中，存于-20℃冰箱。3
5、.冰凍切片用OCT包埋劑包埋腦組織，將其固定在冰凍切片機(jī)的載物臺(tái)上，-20℃冰凍30min。然后開始做連續(xù)恒冷冠狀切片，腦片厚20～40μm。切片按需要分部收集于0.01mol/LPBS中。通常收集三套切片：第一套切片進(jìn)行c-Fos免疫組織化學(xué)反應(yīng)；第二套切片用于免疫組化陰性對照實(shí)驗(yàn)；第三套切片中性紅或焦油紫染色，用于核團(tuán)定位。4.阻斷內(nèi)源性酶活性漂浮的腦切片先用0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min（以3×5min表示，下同）。隨后，3%過氧化氫-甲醇溶液室溫孵育30min。之后，PBS
6、充分漂洗，3×5min。5.封閉處理5%正常羊血清或2%牛血清白蛋白（含0.3%TritonX-100）室溫孵育腦切片30min。孵育完成后，吸出封閉液，勿沖洗。6.一抗（兔抗大鼠c-Fos抗體）孵育兔抗大鼠c-Fos抗體（1：2000，sc-52，SantaCruzBiotechnologyInc，USA）（含0.3%TritonX-100和3%正常羊血清）37℃孵育2～4h或4℃孵育過夜。陰性對照腦切片，用PBS、正常羊血清或牛血清白蛋白代替一抗孵育。孵育完成后，0.01mol/LPBS充分漂
7、洗，3×5min。7.生物素化二抗孵育適度稀釋的生物素化羊抗兔IgG（含0.3%TritonX-100和3%正常羊血清)常溫孵育1h，0.01mol/LPBS充分漂洗，3×5min。7.酶標(biāo)試劑檢測適度稀釋的鏈親和素辣根過氧化物酶復(fù)合物（含0.3%TritonX-100）常溫孵育1h，0.01mol/LPBS充分漂洗，3×5min。8.DAB顯色DAB顯色液處理腦切片3～5min，0.01mol/LPBS漂洗終止顯色反應(yīng)。9.貼片、復(fù)染和封片腦切片充分漂洗后，貼片，略干。蘇木精染液輕度復(fù)染（必要時(shí)
8、），自來水沖洗，自然干燥，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。10.顯微鏡下觀察或用圖像分析系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。c-Fos陽性神經(jīng)元的細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色，而陰性神經(jīng)元的細(xì)胞核呈藍(lán)紫色（圖46-1）。圖46-1束縛-浸水應(yīng)激60min誘導(dǎo)的大鼠腦干孤束核中c-Fos蛋白的表達(dá)（400×）【注意事項(xiàng)】1.大鼠腦組織在冰凍切片前必須在蔗糖溶液內(nèi)浸泡，直至沉底，因?yàn)楸鶅鲞^程中組織和細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有破壞作用。2.抗體在使用前應(yīng)先摸清其效價(jià)和最適稀釋度。理想的稀釋
