寨卡提取物體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其作用機(jī)制研究

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1、寨卡提取物體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其作用機(jī)制研究作者：江南，曾瑾，清源，羅霞，楊志榮【摘要】　　目的研究寨卡提取物誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法以寨卡提取物作用于人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，采用MTT法分析寨卡提取物對(duì)LoVo腫瘤細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)作用；采用AnnexinV-FITC熒光染色實(shí)驗(yàn)，考察細(xì)胞在藥物作用下的質(zhì)膜變化，對(duì)提取物誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)；采用比色法測(cè)定寨卡提取物對(duì)人大腸癌LoVo腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭作用和對(duì)谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）的誘導(dǎo)作用；同時(shí)利用DCF

2、H-DA探針，檢測(cè)LoVo腫瘤細(xì)胞給藥后的活性氧水平；應(yīng)用ethodsMTTassayployedtoevaluatethesurvivalofLoVocells.Theinductionofapoptosisanner,andIC50l-1.ZAFcouldobviouslydepletthelevelofGSHlevel,increaseactivityofGST,andaccumulateROSinLoVocells.Over-expressionofCaspase-3andCaspase-9mediatedbyZAFinaconcentr

3、ation-dependentmannerancolorectalcarcinoma；LoVocells　　寨卡是一味常用藏藥，為十字花科植物ThlaspiarvenseLinn.的干燥成熟種子。在傳統(tǒng)藏醫(yī)藥應(yīng)用中，寨卡性辛、微溫，具有散風(fēng)明目，活絡(luò)通痹，溫補(bǔ)五臟，清肺熱、腎熱，健胃之功效，主要用于治療目赤腫痛流淚，肺熱，咳嗽，腎熱，淋病，消化不良，嘔吐等病癥。目前針對(duì)寨卡化學(xué)成分缺乏系統(tǒng)細(xì)致的報(bào)道，僅通過初步的植物化學(xué)研究所知，寨卡含黑芥子苷（Sinigrin），又含脂肪油34％，揮發(fā)油0.836％，蔗糖1.8％，卵磷脂1.6％等［1］。本課題

4、組的前期研究工作發(fā)現(xiàn)，寨卡中含有活性強(qiáng)烈的抗腫瘤成分，其有效部位為十字花科植物中富含的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）類物質(zhì)［2］，該有效部位提取物ZAF體外抗腫瘤作用與其抑制細(xì)胞增值和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［3］，本研究對(duì)寨卡提取物誘導(dǎo)LoVo腫瘤細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)和影響途徑進(jìn)行研究，以探討寨卡提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為開辟寨卡新的藥用途徑奠定理論基礎(chǔ)?！　?材料與儀器　　1.1藥品與試劑　　寨卡有效部位提取物（activefractionsofpennycress，ZAF），由四川省中醫(yī)藥研究院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。RPM

5、I-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；小牛血清（HyClone公司）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)研究所）；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；活性氧檢測(cè)試劑盒（購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗肌動(dòng)蛋白（β-actin）、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9）抗體、抗小鼠IgG、及抗兔IgG均為SantaCruz產(chǎn)品；ECL檢測(cè)底物I和II（Pierce公司）；臺(tái)盼藍(lán)，MTT，

6、SDS，胰蛋白酶，EDTA·4Na均購自Sigma公司；青霉素，慶大霉素及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；硝酸纖維素膜(博士德)?！　?.2儀器與設(shè)備　　倒置顯微鏡（Nikon，TS10）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，BB5060UV）；酶標(biāo)儀（ThemoElectron，Multiskan）；垂直電泳槽(Bio-radMini-PROTEAN3)；轉(zhuǎn)印槽(Bio-radTrans-blot)；凝膠成相系統(tǒng)（Bio-Rad，ChemiDocXRS）；電泳電源(Bio-radPog·L-1），放置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行

7、實(shí)驗(yàn)?！　?.2細(xì)胞增殖抑制作用的檢測(cè)　　LoVo細(xì)胞（5.0×104個(gè)細(xì)胞/孔）接種于96孔板，用不同濃度的ZAF作用48h后，采用MTT法［4］，酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A570），每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞抑制率（%）=（對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A）/（對(duì)照組A-空白組A）×100%。并計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?！　?.3AnnexinV-FITC/PI熒光雙染色　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LoVo細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種于24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，預(yù)培養(yǎng)24h。設(shè)置3個(gè)藥物作用濃度，分別為300，550，1000μg·ml-1，每種濃度設(shè)3

8、個(gè)平行孔，同時(shí)做陰性對(duì)照孔（加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物；即藥物濃度為0μg·ml-1）。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)36h。利用AnnexinV-FIT