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《離體培養(yǎng)神經干細胞中nmda受體亞單位nr2b的表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在應用文檔-天天文庫。
1、離體培養(yǎng)神經干細胞中NMDA受體亞單位NR2B的表達摘要:目的研究離體培養(yǎng)的大鼠神經干細胞(NSCs)中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR2B的表達。方法從孕18~19天胎鼠海馬中分離、培養(yǎng)、傳代、鑒定NSCs,用免疫細胞化學、DA受體亞單位NR2B的表達。結果源自孕18~19天胎鼠海馬的NSCs,即可以表達NM-DA受體亞單位NR2B。結論體外培養(yǎng)的NSCs能表達NMDA受體亞單位NR2B?! £P鍵詞:神經干細胞;NMDA受體亞單位2B;DAreceptorsubunit2Bintheculturedneurals
2、temcells(NSCs).MethodsNSCsfromthehippocampusofratsatembryonicday18-19ethyl-D-aspartate(NMDA)receptorsubunit2BinthepassagedNSCsinedbyim-munocytochemistryandDAreceptorsubunit2B.ConclusionNSCscanexpressNMDAreceptorsubunit2Binvitro.Keycells;NMDAreceptorsubunit2B;DA受體導致神經元
3、和神經膠質細胞的死亡[2]。已有研究表明,在體外培養(yǎng)的神經元上表達N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體[3],那么NSCs是否表達NMDA受體,其對細胞會產生何種影響還不是很清楚。本實驗初步研究了NSCs上NR2B的蛋白質的表達?! ?材料和方法1.1材料孕18~19天SD(Sprague-Daa公司)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體(Sigma公司)、β-Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲtubu-lin)單克隆抗體(Sigma公司)、山羊抗NR2B多克隆抗體(SantaCruz公司)、生物素標記兔抗山羊IgG和羊抗小鼠IgG(北
4、京中杉生物試劑公司)、堿性磷酸酶標記兔抗山羊IgG(北京中杉生物試劑公司)、兔抗山羊FITC-IgG(JacksonImmonoResearch公司)、山羊抗鼠TRITC-IgG(JacksonImmonoResearch公司)、山羊抗鼠FITC-IgG(JacksonImmonoResearch公司)。DAB(北京中杉生物試劑公司),多聚賴氨酸(Sigma公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物試劑公司)。儀器:CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國),熒光倒置相差顯微鏡(OlympusIX70,日本),Mini-PROTEAN3Ce
5、ll(BIORAD,美國),分光光度計(722N,上海),低溫高速離心機(Eppendorf,德國),蛋白質轉膜儀(BIORAD公司)?! ?.3方法1.3.1大鼠胚胎NSCs的分離培養(yǎng)取孕18~19天大鼠,麻醉后處死,消毒取胎鼠,將胎鼠置于0.5%碘伏中消毒,取腦,分離海馬,置于盛有少量高糖DMEM.F12基礎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中;將組織盡量剪碎,加入基礎培養(yǎng)液5ml,吹打制成細胞懸液,400目篩網過濾,臺盼藍染色,細胞計數,以2×109個細胞.L接種到6孔培養(yǎng)板內,最后加入h-EGF(20μg.L)和h-bFGF(20μg.L),
6、置37℃、5%CO2、95%空氣、平衡濕度培養(yǎng)箱中,倒置顯微鏡觀察。每7~10天傳代1次。1.3.2NSCs的nestin鑒定取傳代1次的神經干細胞球種于鋪有多聚賴氨酸(100mg.L)的24孔培養(yǎng)板中,4h后行間接熒光免疫細胞化學染色:①4%多聚甲醛固定10~15min;②0.01mol.LPBS洗5min×3次;③10%羊血清37℃孵育30min;④加入抗nestin(小鼠單抗1∶500),4℃過夜,陰性對照組僅加一抗稀釋液0.01mol.LPBS,其余步驟相同;⑤0.01mol.LPBS洗5min×3次;⑥加山羊抗鼠FITC
7、-IgG熒光二抗(1∶200),37℃,1h;⑦0.01mol.LPBS洗5min×3次,倒置熒光顯微鏡觀察拍照。1.3.3NSCs的誘導分化及其鑒定將傳代1次的神經干細胞球和培養(yǎng)液移入離心管,離心去除舊培養(yǎng)液,加含1%FBS的DMEM.F12,種于鋪有多聚賴氨酸(100mg.L)的24孔培養(yǎng)板中,于12h~14天時,行免疫細胞化學反應:①4%多聚甲醛固定15min;②3%過氧化氫封閉15min;③10%羊血清37℃孵育30min;④分別加入抗β-Ⅲtubulin(小鼠單抗1∶1000)或抗GFAP(小鼠單抗1∶500)抗體,4℃
8、過夜,陰性對照組僅加一抗稀釋液0.01mol.LPBS,其余步驟相同;⑤加生物素標記羊抗小鼠IgG,37℃,30min;⑥加辣根過氧化物酶(HRP)標記的卵白素-生物素復合物;⑦DAB.過氧化氫(0.05%.0.01%)呈色,倒置顯微鏡觀察拍照。除