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《離體培養(yǎng)神經干細胞中nmda受體亞單位nr2b的表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在應用文檔-天天文庫。
1、離體培養(yǎng)神經干細胞中NMDA受體亞單位NR2B的表達摘要:目的研究離體培養(yǎng)的大鼠神經干細胞（NSCs）中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞單位NR2B的表達。方法從孕18～19天胎鼠海馬中分離、培養(yǎng)、傳代、鑒定NSCs，用免疫細胞化學、DA受體亞單位NR2B的表達。結果源自孕18～19天胎鼠海馬的NSCs，即可以表達NM-DA受體亞單位NR2B。結論體外培養(yǎng)的NSCs能表達NMDA受體亞單位NR2B?！ ￡P鍵詞:神經干細胞;NMDA受體亞單位2B;DAreceptorsubunit2Bintheculturedneurals
2、temcells（NSCs）.MethodsNSCsfromthehippocampusofratsatembryonicday18-19ethyl-D-aspartate（NMDA）receptorsubunit2BinthepassagedNSCsinedbyim-munocytochemistryandDAreceptorsubunit2B.ConclusionNSCscanexpressNMDAreceptorsubunit2Binvitro.Keycells;NMDAreceptorsubunit2B;DA受體導致神經元
3、和神經膠質細胞的死亡［2］。已有研究表明，在體外培養(yǎng)的神經元上表達N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體［3］，那么NSCs是否表達NMDA受體，其對細胞會產生何種影響還不是很清楚。本實驗初步研究了NSCs上NR2B的蛋白質的表達?！ ?材料和方法1.1材料孕18～19天SD（Sprague-Daa公司）、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Sigma公司）、β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲtubu-lin）單克隆抗體（Sigma公司）、山羊抗NR2B多克隆抗體（SantaCruz公司）、生物素標記兔抗山羊IgG和羊抗小鼠IgG（北
4、京中杉生物試劑公司）、堿性磷酸酶標記兔抗山羊IgG（北京中杉生物試劑公司）、兔抗山羊FITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）、山羊抗鼠TRITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）、山羊抗鼠FITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）。DAB（北京中杉生物試劑公司），多聚賴氨酸（Sigma公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物試劑公司）。儀器:CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國），熒光倒置相差顯微鏡（OlympusIX70，日本），Mini-PROTEAN3Ce
5、ll（BIORAD，美國），分光光度計（722N，上海），低溫高速離心機（Eppendorf，德國），蛋白質轉膜儀（BIORAD公司）?！ ?.3方法1.3.1大鼠胚胎NSCs的分離培養(yǎng)取孕18～19天大鼠，麻醉后處死，消毒取胎鼠，將胎鼠置于0.5%碘伏中消毒，取腦，分離海馬，置于盛有少量高糖DMEM.F12基礎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中;將組織盡量剪碎，加入基礎培養(yǎng)液5ml，吹打制成細胞懸液，400目篩網過濾，臺盼藍染色，細胞計數，以2×109個細胞.L接種到6孔培養(yǎng)板內，最后加入h-EGF（20μg.L）和h-bFGF（20μg.L），
6、置37℃、5%CO2、95%空氣、平衡濕度培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡觀察。每7～10天傳代1次。1.3.2NSCs的nestin鑒定取傳代1次的神經干細胞球種于鋪有多聚賴氨酸（100mg.L）的24孔培養(yǎng)板中，4h后行間接熒光免疫細胞化學染色:①4%多聚甲醛固定10～15min;②0.01mol.LPBS洗5min×3次;③10%羊血清37℃孵育30min;④加入抗nestin（小鼠單抗1∶500），4℃過夜，陰性對照組僅加一抗稀釋液0.01mol.LPBS，其余步驟相同;⑤0.01mol.LPBS洗5min×3次;⑥加山羊抗鼠FITC
7、-IgG熒光二抗（1∶200），37℃，1h;⑦0.01mol.LPBS洗5min×3次，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。1.3.3NSCs的誘導分化及其鑒定將傳代1次的神經干細胞球和培養(yǎng)液移入離心管，離心去除舊培養(yǎng)液，加含1%FBS的DMEM.F12，種于鋪有多聚賴氨酸（100mg.L）的24孔培養(yǎng)板中，于12h～14天時，行免疫細胞化學反應:①4%多聚甲醛固定15min;②3%過氧化氫封閉15min;③10%羊血清37℃孵育30min;④分別加入抗β-Ⅲtubulin（小鼠單抗1∶1000）或抗GFAP（小鼠單抗1∶500）抗體，4℃
8、過夜，陰性對照組僅加一抗稀釋液0.01mol.LPBS，其余步驟相同;⑤加生物素標記羊抗小鼠IgG，37℃，30min;⑥加辣根過氧化物酶（HRP）標記的卵白素-生物素復合物;⑦DAB.過氧化氫（0.05%.0.01%）呈色，倒置顯微鏡觀察拍照。除
