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《羅格列酮改善高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗機(jī)制的研究論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、羅格列酮改善高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗機(jī)制的研究論文.freelg/kg，羅格列酮粉劑（99%）由史克必成有限公司提供，其余兩組給予相當(dāng)劑量的蒸餾水灌胃，實(shí)驗(yàn)周期為7周。1.2空腹血糖、胰島素（Ins）的測定大鼠禁食8～10h后，從后眼眶靜脈叢取血，血糖用葡萄糖氧化酶法測定。胰島素以放射免疫法檢測。采用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的放免試劑盒及上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn)的SN-682型放射免疫計(jì)數(shù)儀測定血清胰島素。1.3胰島素敏感性的測定動(dòng)物空腹采血后恢復(fù)2～3天再行葡萄糖-胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（G-InsTT）測定大鼠
2、胰島素敏感性。大鼠于非空腹?fàn)顟B(tài)下，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，行頸外靜脈和股動(dòng)脈插管，先從靜脈注射葡萄糖（700mg/kg），隨即注射普通胰島素（0.175u/kg），從股動(dòng)脈抽血用葡萄糖氧化酶法，測定實(shí)驗(yàn)前及注射胰島素完畢后第3、6、9、12、15min的血糖值。胰島素敏感性用K值表示，具體方法為：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血糖值經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)化后為縱坐標(biāo)，直線回歸所得到的回歸系數(shù)乘以-100即為K值。K值減小表示機(jī)體對胰島素不敏感，即有IR。1.4脂肪組織的留取葡萄糖-胰島素耐量實(shí)驗(yàn)測定后，大鼠斷頭處死，盡可能留取同一
3、部位股部皮下、附睪周圍腹腔脂肪組織，即刻采用上海天平儀器廠生產(chǎn)的電子微量天平稱重。稱重后保存在-80℃液氮中。1.5脂肪組織中腫瘤壞死因子（TNF-α）、瘦素（leptin）、PPAR－γ基因mRNA水平的測定取附睪周圍腹腔凍存的脂肪組織（0.9g），用TRIzol一步法提取總RNA，經(jīng)電泳顯示28S、18S條帶，測定OD260/OD280比值大于1.8。應(yīng)用RT-PCR法檢測脂肪組織中TNF-α、leptin、PPAR－γ基因mRNA表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶及緩沖液購自Promega公司，PCRmarke
4、rs由華美生物工程公司提供。引物序列為：TNF-α有義鏈5′-AGGCGCTCCCCAAAAAGATG-3′，無義鏈5′-TGGCGGAGAGGAGGCTGACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物480bp；Leptin有義鏈5′-ACCCCAGCGAGGAAAATGTG-3′，無義鏈5′-GGAAGGCAAGCTGGTGAGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物288bp；PPAR-γ有義鏈5′-AAGACATCCCGTTCACAAGA-3′，無義鏈5′-GCTGGTCGATATCACTGGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物459bp；內(nèi)參照GAPDH有義鏈
5、5′-TTCATTGACCTCAACTACATG-3′，無義鏈5′-GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物443bp。由上海博彩生物試劑公司合成。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中包括10×PCR緩沖液2.5μl、25mmol/LMgCl21.5μl、10mmol/LdNTPs0.5μl、引物2μl、Taq酶2.5μl、cDNA2μl。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性×1min，58℃退火×1.5min，72℃2min，循環(huán)35次，最后7次延長至10min，4℃保存。取產(chǎn)物10μl用2％瓊脂糖凝膠電泳，60
6、V電泳1h，透射紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。通過電泳圖像分析儀進(jìn)行灰度測量，基因表達(dá)水平用TNF-α、leptin、PPAR-γ與GAPDH灰度比值表示。1.6脂肪細(xì)胞凋亡觀察取液氮中腹腔內(nèi)附睪周圍脂肪組織，在-30℃冰凍切片機(jī)中切成8μm薄片，貼在涂有多聚賴氨酸的載玻片上，37℃烤30min，用4%多聚甲醛固定30min，0.01%TritonX-100-PBS洗3×3min，再用0.4%胃蛋白酶消化30min，PBS洗3×3min，加TUNEL混合液，37℃×1h，PBS洗3×3min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀
7、察。觀察后再PBS洗3×3min，滴加抗FITC二抗（即用液）4℃過夜，PBS洗3×3min，AKP顯色30min，核固紅襯染，PBS洗3×3min，明膠甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。采用TUNNEL法，按試劑盒說明的步驟進(jìn)行染色。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)400倍視野中的陽性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本共隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算平均數(shù)。TUNEL試劑盒由Roche公司生產(chǎn)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有定量指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。2結(jié)果2.1一般指標(biāo)的改變實(shí)驗(yàn)期間，各組攝食量
8、未見明顯差異，高脂飼養(yǎng)2組大鼠大便較正常對照組偏少、較軟。高脂飼養(yǎng)2組大鼠體重較正常對照組增高，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。表1各組大鼠體重的變化（x±s，g）2.2血糖、胰島素的改變高脂飼養(yǎng)2組空腹及餐后血糖較正常對照組明顯升高（P0.05）。與高脂對照組相比，藥物治療組血糖有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂飼養(yǎng)2組動(dòng)物空腹胰島素水平明顯升高，與正常對照組相比差異有顯著性（P0.05），
