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《人源抗her2單鏈抗體-輕鏈恒定區(qū)-魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、人源抗HER2單鏈抗體/輕鏈恒定區(qū)/魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定王凱，溫偉紅，王濤，張瑞，秦?zé)槦?，雷小英，楊安鋼【關(guān)鍵詞】HER2；,單鏈抗體；,魚精蛋白 ConstructionandexpressionofhumanantiHER2ScFv/Ck/tPfusionproteininE.coliandidentificationofitsactivity 【Abstract】AIM:ToconstructafusionproteingeneofhumanantiHER2ScFv
2、/lightchainconstantregion/truncatedprotamine(ScFv/Ck/tP)andanalyzethebindingactivityoftheexpressedprotein.METHODS:TersplifytheScFvandtheCkgene.Aftertheyinusofit,thenthefusionproteingeneScFv/Ck/tPedbycellularELISA,andtheDNAbindingabilityedbygelshiftassay.
3、RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencingprovedthatScFv/Ck/tPedthatithadspecificantigenbindingactivity;gelshiftassayassuredthatithadDNAbindingability.CONCLUSION:TheScFv/Ck/tPfusionproteinexpressedinE.colicouldspeciallybindine 【摘要】目的：構(gòu)建人抗H
4、ER2單鏈抗體(ScFv)/人輕鏈恒定區(qū)（Ck）/魚精蛋白截短體(tP)融合蛋白基因，在大腸桿菌中表達(dá)、純化并分析該融合蛋白的活性.方法：設(shè)計引物擴增人抗HER2單鏈抗體e23sFv基因和輕鏈恒定區(qū)編碼序列(Ck)，連接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，連接于ScFv/Ck末端，構(gòu)建成ScFv/Ck/tP融合基因，將其克隆入原核表達(dá)載體pET32a后，在大腸桿菌BL21(DE3)LysS中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE和Ve23sFvPEIIGrBa〔6〕，pb3HFab15，pUC19，pE
5、T32a；大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)LysS和HER2陽性的人胃癌細(xì)胞系SGC7901（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）；限制性內(nèi)切酶、連接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美國Promega公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒（合肥優(yōu)晶生物技術(shù)有限公司）；HiTrapNiNTA螯合層析介質(zhì)(美國Invitrogen公司)；6HismAb（德國Qiagen公司）；HRP－羊抗鼠IgG（武漢博士德生物有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；
6、RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）. 1.2方法 1.2.1引物和tP編碼序列寡核苷酸的設(shè)計與合成 設(shè)計擴增ScFv基因的引物S5：5＇tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3＇，S3：5＇tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3＇，在兩端引物中分別引入EcoRI和XhoI酶切位點（下劃線部分）.擴增Ck序列的引物Ck5：5＇tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3＇，Ck3：5
7、＇ttttctagactaacactctcccctgttga3＇，在兩端引物中分別引入XhoI和XbaI酶切位點（下劃線部分）.tP編碼序列寡核苷酸合成tP1：5＇ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc3＇，tP2：5＇tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgcttcctccgcctcgcgccgg3＇，寡核苷酸鏈的兩端帶有XbaI
8、和NotI酶切位點的粘端序列（下劃線部分），能夠直接與經(jīng)XbaI和NotI酶切的載體連接.引物和寡核苷酸由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成. 1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 分別以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pb3HFab15質(zhì)粒為模板，S5，S3和Ck5，Ck3為引物PCR擴增ScFv和Ck片段，產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的酶切后，一起克隆入pUC19質(zhì)粒，并進行序列測定，測序正確后的質(zhì)粒命名為pUC19ScFv
