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《重組胸腺素α1 的克隆、表達(dá)與純化論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重組胸腺素α1的克隆、表達(dá)與純化論文.freelosinalpha1，Tα1）的串聯(lián)體并進(jìn)行純化、鑒定.方法將Tα1的基因拆分為4個(gè)片段進(jìn)行合成，退火后經(jīng)PCR獲得串聯(lián)體基因，測(cè)序正確后克隆在硫氧還蛋白（thioredoxin）融合蛋白表達(dá)載體pThioHisA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過80℃熱處理及陰離子交換柱Q-SepharoseFastFloosinα1;tandemrepeat;cloning;geneex-pression;fusionproteinsAbstract:AIMToexpresstand
2、emrepeatofthymosinalpha1（Tα1）ethodandtopurifyandiden-tifythefusionprotein.METHODSSplitTα1geneintofourfragments，synthesizethemrespectivelyandgetthetandemrepeatgeneofTα1byannealingandPCR.Aftersequencingtoidentifyitscorrectness，clonethegeneintofusionexpres-sionvectorpThioHisA，trans
3、formstheE.colistrainTOP10idandinducesentandQSepharoseFastFloatographyandi-dentifiedbyolecularethodofexpressingtandemrepeatgeneispractical.ThesuccessfulexpressionofTα1③hasestablishedafoundationforitsbiologicalactivityresearch.0引言1966年Goldstein等［1］首次報(bào)道了從小牛胸腺中提取的初步具有生物活性的激素樣物質(zhì)，命名為胸
4、腺素.隨后的研究表明，它是由動(dòng)物胸腺上皮細(xì)胞分泌的一類多肽和蛋白質(zhì)激素的總稱.胸腺素α1（thy-mosinalpha1，Tα1）是從胸腺素組分5（TF5）中分離純化出的熱穩(wěn)定酸性多肽［2］，由28個(gè)氨基酸組成，pI值為4.2，相對(duì)分子質(zhì)量為3108.它是一種具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)劑，已應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥［3］和免疫缺陷的研究中.雖然Tα1有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其編碼的多肽過短，很難利用基因工程方法實(shí)現(xiàn)直接表達(dá)，所以目前商用的多是化學(xué)合成產(chǎn)品，價(jià)格較貴，使其臨床應(yīng)用受到限制.為了探索Tα1多聚體的可能的生物學(xué)活性及其基因的體外表達(dá)，我
5、們利用隨機(jī)退火與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法構(gòu)建了Tα1的多串體基因，在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)了表達(dá)，純化后獲得了Tα1③融合蛋白，從而為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料pGEM-3zf（-），pThioHisA質(zhì)粒、DH5α，TOP10菌種由本中心保存，T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶、EcoRI、PstI為TaKaRa產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自華美生物工程公司，低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（Mr14400～97400）購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司，I抗Anti-ThioTMAntibody為Invitrogen產(chǎn)品，II
6、抗為Rabbitanti-MouseIgG-AP為華美公司產(chǎn)品.Tα1基因片段及PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成:sequence1（54bp）GACACCAGCAGCGAGATCACCACCAAGGACCGGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTG;sequence2（30bp）GAGGAGGCCGAGAACAGCGACGCCGCCGTG;sequence3（42bp）CTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCACGGCGGCGTCGCT;sequence4（42bp）GTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCT
7、TCTCCTTCAGGTC;上游引物（38bp）GGAATTCATGTCTGATGCAGCCGTGGACACCAGCAGCG;下游引物（35bp）GCACTGCAGTCAGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCT.1.2方法1.2.1串聯(lián)體基因的獲得將Tα1的氨基酸序列［4］按慣用碼轉(zhuǎn)化為核苷酸序列，并將其拆分成4個(gè)片段合成，合成產(chǎn)物的5’端磷酸化后進(jìn)行退火，退火產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.首先95℃處理5min，加入Taq酶后進(jìn)行30次循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為:95℃1min，60℃45s，72℃1min，最后一次延伸反應(yīng)10min.1.2.2PCR產(chǎn)物的克
8、隆、酶切和序列鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切取目的條帶，用試劑盒進(jìn)行純化回收，經(jīng)EcoRI
