ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

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1、Ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的探討Ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常對(duì)照組（N組）；②高糖組（H組）；③高糖+Ghrelin組（G組）。應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡，分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)caspase3活性的變化。結(jié)果與N組比較，H組心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，caspase3活性顯著升高；與H組比較，G組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，caspase3活性明顯降低（均P＜0.05）。結(jié)論Ghrelin可能通過降低caspa

2、se3活性抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】Ghrelin；高血糖；心肌細(xì)胞；凋亡caspase3　　心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改變之一，長期心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，將會(huì)導(dǎo)致臨床早期心肌舒張功能障礙、晚期合并心肌收縮功能障礙及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可以抑制多種細(xì)胞的凋亡，如成骨細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元等，但Ghrelin對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以高糖環(huán)境培養(yǎng)心肌細(xì)胞，Ghrelin作為干預(yù)因素，旨在探討Ghrelin對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響，從而為糖

3、尿病心肌病的防治提供新思路。12　　1材料與方法　　1.1材料　　1.1.1細(xì)胞來源　　新生1～3d的SD大鼠的心肌細(xì)胞（重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）?！　?.1.2主要試劑　　Ghrelin(美國PhoenixBiotech公司)，DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅱ型膠原酶及胰酶（均購于Sigma公司），PBS、αactin單克隆抗體、SABC試劑盒、TUNEL檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒（均購于武漢博士德生物技術(shù)公司），caspase3活性檢測(cè)試劑盒（購于南京凱基生物公司）?！　?.2實(shí)驗(yàn)方法　　1.2.

4、1原代心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)　　取出生1～312d齡SD大鼠10～15只，無菌條件下取心臟，仔細(xì)剝離心包膜去除心房及大血管，剩余組織于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶側(cè)壁上，用眼科剪將心組織剪成約1mm3碎塊。加入5倍體積的0.08％胰蛋白酶，反復(fù)吹打后36℃水浴消化7min，靜置，待自然沉降后棄上清。剩余沉淀再加入約5倍體積0.08％胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8min，靜置后將上清液移入10ml離心管中，反復(fù)吹打至無細(xì)胞團(tuán)塊后用等體積含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。剩余沉淀用同樣條件及方法繼續(xù)消化，一般經(jīng)8～

5、10次消化即可將組織消化完畢。各次消化產(chǎn)物以1000r／min離心8min，棄去上清液后將細(xì)胞重懸于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后接種于50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5h去除貼壁的成纖維細(xì)胞。輕輕吸出上層細(xì)胞懸液，調(diào)整接種密度，將細(xì)胞接種于24孔板（板底鋪蓋玻片），置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)液中加入5溴脫氧尿嘧啶0.1mmol/L,以抑制成纖維細(xì)胞增殖)，培養(yǎng)48h換液，以后每2d換液1次。　　1.2.2臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原代心肌細(xì)胞存活率　　將0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液等比例混勻，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，2mi

6、n后于倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率〔%，活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%〕，重復(fù)3次。12　　1.2.3心肌細(xì)胞純度鑒定　　細(xì)胞培養(yǎng)第3天取出細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定30min后，用0.01mol／LPBS漂洗3次。加入3％H2O2消除過氧化氫酶，封閉血清，室溫封閉30min后加入以１∶300稀釋的兔抗大鼠特異性αactin抗體于4℃孵育過夜。然后分別用熒光標(biāo)記的山羊抗兔ＩｇＧ抗體37℃避光孵育60min。PBS清洗3次后立刻熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光染色的細(xì)胞即為陽性心肌細(xì)胞。陽性細(xì)胞百分

7、率(%)＝陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，重復(fù)3次?！　?.2.4實(shí)驗(yàn)分組　　原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)3ｄ后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，分為以下3組：①正常對(duì)照組（N組)：葡萄糖濃度為5.5mmol／L;②高糖組（Ｈ組）：葡萄糖濃度為25.0mmol/L；③高糖+Ghrelin組（G組）：?；疓hrelin終濃度為107mol/L，葡萄糖濃度為25.0mmol/L?！　?.2.5TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡　　將各組細(xì)胞爬片用PBS洗3次后，4％多聚甲醛固定3012min，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)設(shè)置陽性與陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果判斷：光鏡下陽性細(xì)胞為細(xì)胞核

8、中有深淺不一的棕黃色顆粒（DAB顯色）。而正常非凋亡細(xì)胞及陰性對(duì)照胞核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色。凋亡細(xì)胞分析：計(jì)數(shù)200倍視野下