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《實驗三 酵母rna的提取及含量測定》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、華南師范大學(xué)實驗報告學(xué)生姓名吳志軍學(xué)號20082502046專業(yè)生物工程年級、班級08工程1班課程名稱下游技術(shù)實驗項目酵母RNA提取實驗類型驗證設(shè)計綜合實驗時間2011年10月17日實驗指導(dǎo)老師江學(xué)文實驗評分實驗三酵母RNA的提取及含量測定一、實驗?zāi)康呐c要求1、了解并掌握稀堿法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法測定核酸含量原理和操作方法,3、熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法。二、實驗原理由于RNA的來源和種類很多,因而提取制備方法也很各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是
2、實驗是最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后,RNA即溶于上層被酚飽和的水相中,DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后,RNA即以白色絮狀沉淀析出,此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA,用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA,主要用作制備核苷酸的原料,其工藝比較簡單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液,90℃提取3-4h,迅速冷卻,提取液經(jīng)離心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用
3、乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。酵母含RNA達(dá)2.67-10.0%,而DNA含量僅為0.03-0.516%,為此,提取RNA多以酵母為原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)(-C=C一C=C-),能夠強烈吸收250-280nm波長的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律,可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同,紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異,它們的摩
4、爾消光系數(shù)也隨之不同。所以,在測定核酸物質(zhì)時均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。核酸的摩爾消光系數(shù)(或吸收系數(shù)),通常以ε(ρ)來表示,即每升含有一摩爾核酸磷的溶液在260nm波長處的消光值(即光密度,或稱為光吸收)。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個常數(shù),而是依賴于材料的前處理、溶液的pH和離子強度發(fā)生變化。RNA溶液(pH=7.0)的ε(ρ)=7700-7800,RNA的含磷量為9.5%,含1μg/mLRNA溶液的光密度為0.022-0.024。因此,測定未知濃度的DNA(RNA)溶液的光密度OD260nm,即可計算測
5、出其中核酸的含量。該法簡單、快速、靈敏度高,如核酸3μg/mL的含量即可測出。對于含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品,測定誤差較小。蛋白質(zhì)由于含有芳香族氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長處,在260nm波長處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低,故核酸樣品中的蛋白質(zhì)含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。三、主要儀器和試劑啤酒酵母粉0.04MNaOH溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mLHCl。紫外分光光度計離心機真空干燥箱三角瓶、燒杯水浴鍋四、實驗
6、步驟1、稱5g干酵母粉懸浮于30mL0.04MNaOH溶液中,并在研缽中研磨均勻。2、懸浮液轉(zhuǎn)入三角燒瓶,沸水浴加熱30min,冷卻,轉(zhuǎn)入離心管,3000轉(zhuǎn)/分,離心15分鐘后,將上清慢慢傾入10mL酸性乙醇,邊加邊攪動。3、加畢,靜置,待RNA沉淀完全后,3000r/min離心3min。棄去上清液。用95%乙醇洗滌沉淀兩次。4、再用乙醚洗滌沉淀一次后,用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾,沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量,5、純度測定:將樣品配制成含5~50μg核酸/mL的溶液,于紫外分光光度計上測定
7、260nm和280nm吸收值,計算核酸濃度和兩者吸收比值。五、計算:O.D260為260nm波長處的光密度讀數(shù);L為比色杯的厚度,一般為1或0.5;0.024為1μgRNA/mL的光密度;0.020為1μgDNA/mL的光密度。六、實驗結(jié)果與分析各小組測得的實驗數(shù)據(jù)如下表:組別稀釋倍數(shù)吸光值(OD260)116667倍0.523212500倍0.593314000倍0.474412500倍0.574512500倍0.605其中本小組為第5小組,稀釋倍數(shù)為12500倍,測得的吸光值(OD260)為0.605。
8、將酵母粉處理后得到的沉淀的重量為:0.46g。濾紙濾紙+沉淀沉淀重量(g)0.30400.76040.4564其中RNA粗品占沉淀的70%,雜質(zhì)占沉淀的30%,故RNA粗品的重量為:0.46×0.7=0.322g。純度測定結(jié)果為:RNA濃度(ug/g)==RNA純品的質(zhì)量(ug)=RNA濃度×RNA粗品的重量=故甘酵母粉中RNA含量(%)===2.02%分析:實驗的結(jié)果測出RNA的含量為2.02%,其RNA的含量