資源描述：
《實驗三 酵母rna的提取及含量測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、華南師范大學(xué)實驗報告學(xué)生姓名吳志軍學(xué)號20082502046專業(yè)生物工程年級、班級08工程1班課程名稱下游技術(shù)實驗項目酵母RNA提取實驗類型驗證設(shè)計綜合實驗時間2011年10月17日實驗指導(dǎo)老師江學(xué)文實驗評分實驗三酵母RNA的提取及含量測定一、實驗?zāi)康呐c要求1、了解并掌握稀堿法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法測定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法。二、實驗原理由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也很各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是
2、實驗是最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3-4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用
3、乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。酵母含RNA達(dá)2.67-10.0%，而DNA含量僅為0.03-0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（-C=C一C=C-），能夠強烈吸收250-280nm波長的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩
4、爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測定核酸物質(zhì)時均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來表示，即每升含有一摩爾核酸磷的溶液在260nm波長處的消光值（即光密度，或稱為光吸收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個常數(shù)，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH和離子強度發(fā)生變化。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700-7800，RNA的含磷量為9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度為0.022-0.024。因此，測定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計算測
5、出其中核酸的含量。該法簡單、快速、靈敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可測出。對于含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小。蛋白質(zhì)由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長處，在260nm波長處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中的蛋白質(zhì)含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。三、主要儀器和試劑啤酒酵母粉0.04MNaOH溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。紫外分光光度計離心機真空干燥箱三角瓶、燒杯水浴鍋四、實驗
6、步驟1、稱5g干酵母粉懸浮于30mL0.04MNaOH溶液中，并在研缽中研磨均勻。2、懸浮液轉(zhuǎn)入三角燒瓶，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后，將上清慢慢傾入10mL酸性乙醇，邊加邊攪動。3、加畢，靜置，待RNA沉淀完全后，3000r/min離心3min。棄去上清液。用95％乙醇洗滌沉淀兩次。4、再用乙醚洗滌沉淀一次后，用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量，5、純度測定：將樣品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液，于紫外分光光度計上測定
7、260nm和280nm吸收值，計算核酸濃度和兩者吸收比值。五、計算：O.D260為260nm波長處的光密度讀數(shù)；L為比色杯的厚度，一般為1或0.5；0.024為1μgRNA/mL的光密度；0.020為1μgDNA/mL的光密度。六、實驗結(jié)果與分析各小組測得的實驗數(shù)據(jù)如下表：組別稀釋倍數(shù)吸光值（OD260）116667倍0.523212500倍0.593314000倍0.474412500倍0.574512500倍0.605其中本小組為第5小組，稀釋倍數(shù)為12500倍，測得的吸光值（OD260）為0.605。
8、將酵母粉處理后得到的沉淀的重量為：0.46g。濾紙濾紙+沉淀沉淀重量（g）0.30400.76040.4564其中RNA粗品占沉淀的70%，雜質(zhì)占沉淀的30%，故RNA粗品的重量為：0.46×0.7=0.322g。純度測定結(jié)果為：RNA濃度（ug/g）==RNA純品的質(zhì)量（ug）=RNA濃度×RNA粗品的重量=故甘酵母粉中RNA含量（%）===2.02%分析：實驗的結(jié)果測出RNA的含量為2.02%，其RNA的含量
