欖香稀對肺癌細(xì)胞凋亡的影響

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1、欖香稀對肺癌細(xì)胞凋亡的影響許浪劉丹晏丹李玉紅【摘要】目的：研究欖香稀對肺癌細(xì)胞的凋亡作用。方法：采用MTT法和AnnexinV/PI法檢測欖香稀和順鉑作用于肺癌A549細(xì)胞株的毒性和凋亡情況，比較欖香稀和順鉑誘導(dǎo)凋亡的差異。結(jié)果：欖香稀細(xì)胞半數(shù)毒性濃度為102.21μg/m1，欖香稀具有細(xì)胞毒性，且呈量效關(guān)系，但弱于順鉑；欖香稀和順鉑均能促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡，兩者間無明顯差異。結(jié)論：欖香稀可有效誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義。【關(guān)鍵詞】欖香??；肺癌；細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡對腫瘤的產(chǎn)生、生長速度和預(yù)后方面起著非常重要的作用。通

2、過細(xì)胞凋亡可直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長。肺癌是發(fā)病率較高的腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的生命。細(xì)胞凋亡在維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)已成為肺癌治療的一個研究方向。誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，可能遏制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。研究證明，順鉑可誘導(dǎo)人白細(xì)胞HL60細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)明顯的劑量時間依賴性關(guān)系；而且低劑量的順鉑對放射有增敏的作用，放射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也是放療的作用機(jī)制之一〔1〕。順鉑、阿霉素等及放射誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞凋亡的研究已成為腫瘤治療的研究熱點，但欖香稀誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的研究較少。我們應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT法和AnnexinV

3、/PI法檢測欖香稀和順鉑作用于肺癌A549細(xì)胞株的毒性和凋亡情況，比較欖香稀和順鉑誘導(dǎo)凋亡的差異，為臨床肺癌治療提供實驗依據(jù)。1材料和儀器肺癌A549細(xì)胞由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院惠贈，細(xì)胞生長液為高糖DMEM(Gibco)，加10％的胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；新生牛血清，杭州四季清生物工程所生產(chǎn)；欖香稀(elemeneemulsion，ELE，5mg/ml)，大連金港制藥有限公司；AnnexinV/PI試劑盒(BenderMedsystem，USA)。5mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)溶液配制：稱取噻唑藍(lán)粉

4、劑25mg溶解于5mlPBS中，攪拌，使之溶解，雙層0．22m濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱5410型，Napco公司產(chǎn)品；EPICSALTRAⅡ流式細(xì)胞儀(Beckman，USA)；酶標(biāo)儀(美國BIORADmodel550)。2實驗方法2.1肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞采用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)法培養(yǎng)傳代肺癌A549細(xì)胞于25mL培養(yǎng)瓶里。用PBS洗細(xì)胞3次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，每隔1天更換1次培養(yǎng)基，至細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,收集所有細(xì)胞

5、。2.2細(xì)胞毒性實驗（MTT法）用細(xì)胞維持液分別將欖香稀25μg/m1，50μg/m1，100μg/m1，150μg/m1，200μg/m1，300μg/m1，和順鉑(3μg/m1)分別加入96孔板中已長成單層的細(xì)胞中，每個稀釋度接種4個復(fù)孔，每孔加入100μ1，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml的MTT溶液50μ1，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO150μ1，振蕩5～10min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測570nm處的OD值，參考波長為630nm，計算細(xì)胞

6、存活率=藥物對照孔OD值/正常對照孔平均OD值(OD值為每孔在570nm處與630nm處吸光度的差值)。根據(jù)實驗結(jié)果計算細(xì)胞的抑制率與存活率，通過SPSS13.0軟件使用probit回歸法計算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TC50)。2.3流式AnnexinV/PI法分別加入欖香稀(150μg/m1)和順鉑(3μg/m1)的細(xì)胞維持液以1:4稀釋bindingbuffer(50mLbuffer+150mL蒸餾水)，在稀釋的buffer重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度2×105/mL，取195μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinVFITC，室溫孵育10

7、min，洗細(xì)胞n次后，再重懸細(xì)胞于190μLbindingbufer,加入10μLPI，室溫孵育10min，上流式細(xì)胞儀檢測。2.4流式細(xì)胞儀分析AnnexinV/PI法以氬離子激光器488nm為激發(fā)波，分別以525nm、620nm紅色熒光和綠色熒光檢測細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測量軟件檢測每個樣品10000個細(xì)胞，直接測得每個樣本10000個細(xì)胞中正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細(xì)胞所占的比例。3結(jié)果3.1細(xì)胞毒性實驗?zāi)繙y法結(jié)果通過用SPSS13.0軟件probit回歸分析法，計算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TC50),欖香烯為102.21μg/

8、m1。欖香稀有細(xì)胞毒性，有量效關(guān)系，但弱于順鉑。結(jié)果見表1。3.2流式AnnexinV/PI法檢測結(jié)果流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI法檢測欖香稀(150μg/m1)和順鉑(3μg/m1)作用下肺癌A549細(xì)胞凋亡百分率，見圖1。UL