外源性人afgf在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的分泌

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1、外源性人aFGF在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的分泌作者：顏雪蕓,王飛,周卿,榮燁之,陳書艷【關(guān)鍵詞】酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;,信號(hào)肽;,轉(zhuǎn)基因　　[摘要]目的:觀察外源重組分泌型人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（spaFGF）在內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）中的分泌。方法:以腺相關(guān)病毒為載體,將spaFGF基因和綠色熒光蛋白基因（GFP）分別導(dǎo)入內(nèi)皮祖細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)基因EPC和未轉(zhuǎn)基因EPC培養(yǎng)液,用ELISA方法檢測(cè)其中的aFGF蛋白,并比較3組細(xì)胞分泌的aFGF的量。結(jié)果:在感染細(xì)胞的第4天,轉(zhuǎn)基因EPC出現(xiàn)綠色熒光。spaFGFEPC組分泌的aFGF量顯著高于GFPEPC和E

2、PC組[（862±49）ng/Lvs（115±16）ng/L,P<005;（862±49）ng/Lvs（98±10）ng/L,P<005）]。結(jié)論:在EPC中導(dǎo)入外源性spaFGF基因能增強(qiáng)人aFGF的分泌?！　關(guān)鍵詞]酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;信號(hào)肽;轉(zhuǎn)基因　　通過基因修飾的方法促進(jìn)治療性血管新生是近年來心血管領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn),代表著一種克服缺血組織再灌注障礙和促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展的新方向[1]。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（acidicfibroblastgroL含100mL/LFCS的DMEM培養(yǎng)液,37℃、50mL/LCO2,培養(yǎng)24h。

3、吸出6孔板中培養(yǎng)液,按1mL/孔將倍比稀釋的病毒液加到6孔板中,細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1h后,每孔加入1mL含100mL/LFCS的DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)?！　?.2.3AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞將EPC分成3組,按1×105個(gè)/孔接種到6孔板中。分別用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC,未感染的EPC作為對(duì)照,標(biāo)記為spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC。培養(yǎng)液為含50mL/L胎牛血清的EGM2,在37℃、50mL/LCO2中培養(yǎng)24h。用PBS液洗滌細(xì)胞3次,徹底洗去血清成分。在試管中將200μLAAV濃縮液與1mL無血清的EBM2混合,加入到

4、每孔細(xì)胞中。分別標(biāo)記為“EPCspaFGF”,“EPChrGFP”和“EPC”。將細(xì)胞置于37℃、50mL/LCO2中培養(yǎng)2h,期間每隔15min轉(zhuǎn)動(dòng)1次培養(yǎng)板,保證病毒液與細(xì)胞充分接觸。2h后用1mL含50mL/L胎牛血清的EGM2代替無血清的EBM2,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)?！　?.2.4檢測(cè)細(xì)胞分泌的aFGF蛋白收集spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC3組細(xì)胞培養(yǎng)液,離心后,取上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)其中的人aFGF蛋白。取樣品與倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各01mL加入已包被抗人aFGF抗體的酶標(biāo)板中,一孔加樣品稀釋液作為0孔,加蓋。37

5、℃反應(yīng)120min。反應(yīng)后甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,按01mL/孔加入生物素抗人FGFacidic抗體工作液,37℃反應(yīng)60min。01mol/LPBS洗滌后,加入ABC工作液（TMB空白顯色孔除外）,37℃反應(yīng)30min。洗滌后加入TMB顯色液,37℃避光反應(yīng)。30min后加入TMB終止液測(cè)定A450值。　　1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS12.0軟件包分析所得數(shù)據(jù),比較3組細(xì)胞分泌的aFGF,P<005為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。　　2結(jié)果　　2.1AAV感染HT1080細(xì)胞將AAV感染AAVHT1080細(xì)胞,48h后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒

6、光（圖1）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,GFP+細(xì)胞數(shù)約占40%。圖1AAV感染AAVHT1080細(xì)胞（48h后）　　2.2AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞由于AAV載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP中含有編碼綠色熒光蛋白（hrGFP）的基因序列,通過基因克隆的方法,將spaFGF基因插入到GFP基因的上游,通過熒光顯微鏡可實(shí)時(shí)觀察AAV的感染情況。用同樣滴度的AAVspaFGF和AAVGFP分別感染EPC,在感染細(xì)胞的第4天時(shí),轉(zhuǎn)導(dǎo)spaFGF基因的EPC和轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP基因的EPC均出現(xiàn)綠色熒光（圖2）?！　D2AAV感染的EPC（略）　　2.3檢測(cè)3組EPC分泌的人a

7、FGF蛋白轉(zhuǎn)spaFGF基因的EPC分泌的aFGF水平顯著高于轉(zhuǎn)GFP基因EPC和未轉(zhuǎn)基因EPC[（862±49）ng/Lvs（115±16）ng/L,（862±49）ng/Lvs（98±10）ng/L,P<005,而后兩組細(xì)胞分泌的aFGF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（115±16）ng/Lvs（98±10）ng/L,P>005]?！　?討論　　當(dāng)原先的血管不能提供充足的血流時(shí),側(cè)支循環(huán)成為一個(gè)重要的血液供給的來源,因此,研究促血管生長(zhǎng)成為治療缺血性心臟病的一個(gè)新方向。從動(dòng)物模型到臨床試驗(yàn),對(duì)于應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療組織缺血性疾病的研究早已開展[4

8、-6],實(shí)驗(yàn)證實(shí),在缺血心肌局部注射生長(zhǎng)因子能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的發(fā)展[7]。aFGF是一種有效的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分