肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥機制研究

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1、肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥機制研究葉惠芬劉朝暉周小棉陳惠玲趙祝香【摘要】目的研究肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥機制。方法采用濃度梯度法(Etest)測定細菌對各種抗菌藥物最低抑菌濃度，聚合酶鏈反應(PCR)擴增β內(nèi)酰胺酶基因，并對擴增產(chǎn)物進行基因測序，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)進行外膜蛋白(OMP)分析。用抑制試驗進行主動外排機制檢測。結(jié)果4株菌株全部攜帶有SHV12型和DHA1型超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因，3株攜帶CTXM14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌

2、亞胺培南耐藥株與敏感株相比，缺少分子量在32500～47500之間的一條帶，從位置判斷該條帶可能為OMP36000或OMP37000的一種外膜蛋白；主動外排檢測全部為陰性。結(jié)論同時產(chǎn)多種β內(nèi)酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是導致本組肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥的原因。【關(guān)鍵詞】肺炎克雷伯菌；β內(nèi)酰胺酶；外膜蛋白ABSTRACTObjectiveToinvestigatethemechanismofKlebsiellapneumoniaeresistanttoimipenem.MethodsTheminimalinhibitiveco

3、ncentrations(MIC)oftheantimicrobialagentsinedbyEtest.Thegenescodedtheβlactamaseplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),andthesequencesembraneproteins(OMPs)dodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDSPAGE).ReserpineinhibitiontestoniaproducedSHV12andDHA1genoty

4、pe.Theyalsoproducedotherβlactamase(CTXM14type,3isolates).paredtoimipenemsensitiveisolatesbySDSPAGE,theimipenemresistantisolatesmarkedlylackedtheproteinbandofabout36.71kuightbetheoutermembraneproteinsofOmp36,000orOmp37,000accordingtotheelectrophoresismobility.Th

5、eactiveeffluxtestoniaeproducedmorethanoneβlactamaseandthelossofoutermembraneproteinsmaybeaccountedfortheoccurrenceofimipenemresistance.KEYerieux公司的VITEK2全自動鑒定系統(tǒng)鑒定。1.2藥敏試驗采用Etest法測定最低抑菌濃度(MIC)，全部操作與結(jié)果判斷均嚴格按照2005年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)標準進行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和產(chǎn)酶型大腸埃希菌ATC

6、C35218。1.3ESBLs和AmpC酶檢測采用酶提取物三維試驗方法，按照文獻〔3〕操作，以肺炎克雷伯菌ATCC700603和陰溝腸桿菌029M分別作為ESBLs和AmpC酶陽性質(zhì)控菌株跟隨試驗。試驗所用藥敏紙片和瓊脂均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。1.4細菌DNA的提取將平皿上過夜培養(yǎng)的受試菌落接種于5mlLB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)12～16h后，13000r/min離心1min收集沉淀(菌體)；采用賽百盛(SBSGeech)的硅膠膜型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取細菌質(zhì)粒。1.5PCR擴增及序列分析β內(nèi)酰胺酶耐藥基因所用引物2

7、結(jié)果2.1藥敏結(jié)果體外活性試驗表明，4株肺炎克雷伯菌對阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦、頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸的MIC為256μg/ml，亞胺培南、環(huán)丙沙星MIC為32μg/ml，均為多重耐藥。2.2耐藥機制4株亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌主動外排機制檢測和ESBL、AmpC酶、β內(nèi)酰胺酶基因檢測、外膜蛋白表達情況見表1。4株肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥性均較高，但在含利舍平的平板上，其MIC值沒有明顯下降，根據(jù)文獻資料判斷為主動外排機制陰性。SDSPAGE進行外膜蛋白檢測4株亞胺培南耐藥株，加1株亞胺培表

8、14株肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥機制檢測結(jié)果-：陰性；+：陽性。南敏感株作對照檢測，發(fā)現(xiàn)耐藥株全部在32500～47500分子量之間缺失一條帶，從位置判斷可能為OMP36000或OMP37000的一種外膜蛋白。3討論肺炎克雷伯菌引起醫(yī)院感染往往以耐藥菌株為主，2