肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制研究

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1、肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制研究葉惠芬劉朝暉周小棉陳惠玲趙祝香【摘要】目的研究肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制。方法采用濃度梯度法(Etest)測(cè)定細(xì)菌對(duì)各種抗菌藥物最低抑菌濃度，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增β內(nèi)酰胺酶基因，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)進(jìn)行外膜蛋白(OMP)分析。用抑制試驗(yàn)進(jìn)行主動(dòng)外排機(jī)制檢測(cè)。結(jié)果4株菌株全部攜帶有SHV12型和DHA1型超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因，3株攜帶CTXM14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌

2、亞胺培南耐藥株與敏感株相比，缺少分子量在32500～47500之間的一條帶，從位置判斷該條帶可能為OMP36000或OMP37000的一種外膜蛋白；主動(dòng)外排檢測(cè)全部為陰性。結(jié)論同時(shí)產(chǎn)多種β內(nèi)酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是導(dǎo)致本組肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥的原因?！娟P(guān)鍵詞】肺炎克雷伯菌；β內(nèi)酰胺酶；外膜蛋白ABSTRACTObjectiveToinvestigatethemechanismofKlebsiellapneumoniaeresistanttoimipenem.MethodsTheminimalinhibitiveco

3、ncentrations(MIC)oftheantimicrobialagentsinedbyEtest.Thegenescodedtheβlactamaseplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),andthesequencesembraneproteins(OMPs)dodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDSPAGE).ReserpineinhibitiontestoniaproducedSHV12andDHA1genoty

4、pe.Theyalsoproducedotherβlactamase(CTXM14type,3isolates).paredtoimipenemsensitiveisolatesbySDSPAGE,theimipenemresistantisolatesmarkedlylackedtheproteinbandofabout36.71kuightbetheoutermembraneproteinsofOmp36,000orOmp37,000accordingtotheelectrophoresismobility.Th

5、eactiveeffluxtestoniaeproducedmorethanoneβlactamaseandthelossofoutermembraneproteinsmaybeaccountedfortheoccurrenceofimipenemresistance.KEYerieux公司的VITEK2全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。1.2藥敏試驗(yàn)采用Etest法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)，全部操作與結(jié)果判斷均嚴(yán)格按照2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和產(chǎn)酶型大腸埃希菌ATC

6、C35218。1.3ESBLs和AmpC酶檢測(cè)采用酶提取物三維試驗(yàn)方法，按照文獻(xiàn)〔3〕操作，以肺炎克雷伯菌ATCC700603和陰溝腸桿菌029M分別作為ESBLs和AmpC酶陽性質(zhì)控菌株跟隨試驗(yàn)。試驗(yàn)所用藥敏紙片和瓊脂均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。1.4細(xì)菌DNA的提取將平皿上過夜培養(yǎng)的受試菌落接種于5mlLB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)12～16h后，13000r/min離心1min收集沉淀(菌體)；采用賽百盛(SBSGeech)的硅膠膜型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒。1.5PCR擴(kuò)增及序列分析β內(nèi)酰胺酶耐藥基因所用引物2

7、結(jié)果2.1藥敏結(jié)果體外活性試驗(yàn)表明，4株肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦、頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸的MIC為256μg/ml，亞胺培南、環(huán)丙沙星MIC為32μg/ml，均為多重耐藥。2.2耐藥機(jī)制4株亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌主動(dòng)外排機(jī)制檢測(cè)和ESBL、AmpC酶、β內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)、外膜蛋白表達(dá)情況見表1。4株肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥性均較高，但在含利舍平的平板上，其MIC值沒有明顯下降，根據(jù)文獻(xiàn)資料判斷為主動(dòng)外排機(jī)制陰性。SDSPAGE進(jìn)行外膜蛋白檢測(cè)4株亞胺培南耐藥株，加1株亞胺培表

8、14株肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制檢測(cè)結(jié)果-：陰性；+：陽性。南敏感株作對(duì)照檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)耐藥株全部在32500～47500分子量之間缺失一條帶，從位置判斷可能為OMP36000或OMP37000的一種外膜蛋白。3討論肺炎克雷伯菌引起醫(yī)院感染往往以耐藥菌株為主，2