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《黃粉甲抗凍蛋白原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要：昆蟲(chóng)抗凍蛋白具有較高的抗凍活性，生物體內(nèi)微量的抗凍蛋白很難滿足諸多方面應(yīng)用。因此，探索出生產(chǎn)抗凍蛋白的有效方法亟待解決。本研究基于此目的利用基因工程的技術(shù)和方法開(kāi)展了抗凍蛋白基因的分子克隆和表達(dá)工作。以黃粉甲為材料，提取40c冷處理4周的黃粉甲脂肪體總RNA：運(yùn)用R1二PcR技術(shù)擴(kuò)增和克隆出了吃廖72，嘶，84口，q珍8袖，睨勿8和，睨加占4d，斫，8和六個(gè)黃粉甲抗凍蛋白基因，并在Genbank中注冊(cè)。其中基因q彩72經(jīng)核酸和蛋白水平分析確定為新的黃粉甲抗凍蛋白基因，目的基因q和72，q勿8和與其它抗凍蛋白基因具有高度同源性(分別達(dá)到79．48％和98．81％)，分別編碼7
2、2和84個(gè)氨基酸的成熟蛋白，AFP72缺少由12氨基酸組成的的重復(fù)單元，保守單元1’XT在不同序列中具有高度保守性。將基因吃艫力，斫7占婦與載體pMAL-c2x和pMAL—p2x雙酶切后連接，構(gòu)建兩個(gè)融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL—c2x一咖72，pMAL-c2x-q和84盯和兩個(gè)分泌融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-p2x．力，pMAL_p2x．8和：表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E∞，fTBI后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表現(xiàn)為可溶性；通過(guò)優(yōu)化組合，最適的發(fā)酵條件是：誘導(dǎo)溫度為25。c，初始誘導(dǎo)菌濃度氏00為O．6左右，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)，IPTG濃度為0．5r衄。兒。超聲波細(xì)胞破碎法使融合蛋白AFP72從含有融合
3、表達(dá)質(zhì)粒pMAL．c2x．斫，刀的細(xì)胞中釋放。對(duì)于分泌融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL—p2x一吃瑤坫4盯，Mgs04溶解法與超聲波細(xì)胞破碎法均能使目的蛋白從細(xì)胞中釋放，Mgs04的最適濃度為O．05mmol／L。在最優(yōu)條件下融合蛋白AFP84a和AFP72分別占總可溶蛋白的40．5％和38．9％；運(yùn)用親和層析和分子篩層析純化后，sDs—PAGE顯示目的蛋白呈單一條帶；生物活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白具有一定的抗凍活性。關(guān)鍵詞：黃粉甲；抗凍蛋白；RT_PcR；序列分析；融合蛋白；發(fā)酵條件；親和純化；分子篩層析；抗凍活性Abstract：ThethermalhysteresisactivityofaI
4、ltifkezeproteinsisatleastanorderofmagn“udegreaterininsectthan也atobtainedinothero唱anisms．Ane丘bctivemetllodproducinga11ti舶ezeproteillsisallticipated．Fortllispurposemolecularclonjnga11deXpressionofallti船ezcproteingenesbythetechniquesa11dmethodsofgeneengilleeringwercpedb肌ediIlthisresearch．TbtaIRN
5、Awasextractedf硒mt11efatsof跆聆e6，如聊D脅D，exposuredforfollrweeksofcold(40c)．sixgenes(卯72，卯84d，卯占46，q本，84c，q存坫4d，∞84已)wereobtainedbyR1二PCR．Amongtllem，吃勿72isanovelami仔eezeproteillgenethrou曲肌alyzingcDNAfull—lengIllandsequenceof鋤inoacids．Theaimgenes咖刀aIld咖8如sharedhigllhomolo盱麗t11otlleranti?！鎒zepmteill
6、genesof乃聊6，fomoZffD，(94．8％a11d98．81％肋cleotidesidenti夠respectiVely)，wllichcaIlcodeman鵬peptidesof72aaand84aarespectiVely．AFP72isintegcrof12aa-repeatlHlitsshorterthanotherami丹eezepmteinsinlength．AaeraimgencsweresubclonedintoeXpressingplasmidspMAL—c2XandpMAL—p2X，tWorecombinationexpressingplaslIli
7、dspMAL—c2X一曲72，pMAL—c2x一卯占亭口andtwosecreterecombiⅡationexpressingplasmidspMAL—p2X一咖72，pMAL-p2X-印占4Ⅱ、vereconstmcted．AndtllentheobjectivegeneswereeXprcssedinE枷TBI．An叩ticalfeHnentcondmonwasthefollowing：theconcemationofE∞療(A600=0．6)beforeinduction
