核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白ss-s12功能研究

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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss--S12功能研究姓名：余洋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：姜道宏201206核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss-S12功能研究摘要核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum皿ib．)deBary]是一種世界性分布的植物病原真菌，能夠侵染許多重要的農(nóng)作物，引起多種作物如油菜、向日葵和大豆等的菌核病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。菌核是核盤菌越冬、越夏和繁殖的結(jié)構(gòu)，也是菌核病的重要初侵染來源，抑制菌核的形成將切斷菌核病的病害循環(huán)，因此研究核盤菌菌核形

2、成的分子機(jī)理將為菌核病的防治提供新的思路和線索。缺乏簡便穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系是核盤菌基因功能研究的重大障礙。本研究建立了以核盤菌菌絲為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，即直接將含有載體pTFSS的農(nóng)桿菌與新鮮的核盤菌菌絲塊在乙酰丁香酮存在的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，2d后將菌絲塊丟棄并將共培養(yǎng)物置于含30pg／ml潮霉索的PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，3d后獲得轉(zhuǎn)化子。該方法操作簡便，且轉(zhuǎn)化效率較穩(wěn)定，平均每個(gè)培養(yǎng)皿能獲得1-3個(gè)轉(zhuǎn)化子，為深入研究核盤菌菌核形成相關(guān)基因的功能建立了良好的平臺(tái)。本研究還發(fā)現(xiàn)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因

3、在核盤菌轉(zhuǎn)化子的無性階段能穩(wěn)定遺傳，但在有性后代發(fā)生丟失。為深入探索核盤菌菌核形成分子機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)室前期利用Illumina．Solexa技術(shù)建立了核盤菌菌絲生長和菌核形成階段的基因表達(dá)譜。分析該表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，Ss—S12(SSlG05917，XM001592945)的表達(dá)量在菌核形成階段升高了400倍，推測其可能與核盤菌菌核形成密切相關(guān)。本研究表明Ss．S12蛋白全長352aa，具有一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和兩個(gè)PAN模塊，其同源蛋白僅僅出現(xiàn)在部分子囊菌中且均為功能未知蛋白。在核盤菌菌絲生長階段，少量Ss．S12蛋白分

4、布于細(xì)胞壁和隔膜上；在菌核形成階段，Ss-S12表達(dá)量迅速升高，Ss．S12蛋白大量分布于細(xì)胞外加厚的細(xì)胞壁上。Ss-S12的表達(dá)水平受c舢舊水平的抑制，而與環(huán)境pH無關(guān)。Ss-S12基因沉默轉(zhuǎn)化子維持細(xì)胞完整性的能力下降，但是菌絲生長和致病力與野生型菌株沒有差異。在菌核形成初期，Ss-S12沉默轉(zhuǎn)化子可以形成白色絨毛狀菌絲團(tuán)，但是菌絲團(tuán)不能固化和黑化并發(fā)育成熟的菌核，在菌絲團(tuán)內(nèi)部菌絲排列疏松且細(xì)胞壁加厚不明顯，表明Ss．S12在核盤菌菌核形成過程中起著重要作用。對(duì)Ss．S12互作蛋白進(jìn)行鑒定和功能研究將有助

5、于理解其控制菌核形成和維持細(xì)胞完整性的作用機(jī)理。本研究表明3一磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，SSlG一07798)和沃魯寧體主要組成蛋白(Hexl，SSlG一03527)可以與Ss-S12發(fā)生較強(qiáng)的直接相互作用，而轉(zhuǎn)錄延伸因子(EF．1a)則與Ss．S12存在著較弱的直接相互作用。GAPDH基華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆博士研究生學(xué)位論文因沉默轉(zhuǎn)化子只能形成白色絨毛狀菌絲團(tuán)，而不能形成黑色的菌核，與Ss-S12沉默轉(zhuǎn)化子菌核形成表型相似；Hexl基因沉默轉(zhuǎn)化子保持細(xì)胞完整性能力下降，與$s-S12沉默轉(zhuǎn)化子菌絲表型

6、相似，表明Ss．S12可能通過與GAPDH和Hexl的互作來控制核盤菌菌核的形成和維持細(xì)胞的完整性。本研究深入解析了核盤菌Ss．S12蛋白的作用及其機(jī)理，為揭示菌核形成的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為菌核病的防治提供了重要線索：此外，本研究也為探索其它真菌中Ss．S12同源蛋白的功能提供了重要參考。關(guān)鍵詞：核盤菌；菌核；菌核形成；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；Ss．S12,PAN模塊2核盤菌菌核形成相關(guān)蛋白Ss-S12功能研究ABSTRACTSclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBaryisanoto

7、riousfungalpathogenwithworldwidedistribution．Thisfungusmayinfectmanyimportantcrops，suchasoilseedrape，sunflower,soybean,andcauseSclerotiniadiseases．Sclerotiaarenotonlytheimportanttissueforbreedingandoversummerandwinterto＆sclerotiorum，butalsotheimportantsotR'

8、ceofprimarilyinfectionforSclerotiniadiseases．Represstheformationofsclerotiamayinterruptthediseasecycleinducedby＆sclerotiorumandresearchonthemolecularmechanisminvolvedsclerotialdevelopmentmayprovidesome