碭山酥梨果實(shí)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因comt的克隆和表達(dá)分析

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1、分類號(hào)：?jiǎn)挝淮a：10364密級(jí)：學(xué)號(hào)：11720422安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文碭山酥梨果實(shí)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因COMT的克隆和表達(dá)分析CloningandExpressionAnalysisoftheKeyEnzymeCOMTGeneofLigninSynthesisinPyrusbretschneidericv.DangshanSuFruit研究生：程敏指導(dǎo)教師：蔡永萍教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：細(xì)胞生物學(xué)研究方向：分子細(xì)胞生物學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會(huì)主席：二零一四年六月1萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明

2、本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編

3、學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：時(shí)間：年月日第一導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日2萬方數(shù)據(jù)本論文得到了以下科研項(xiàng)目的資助：國(guó)家自然科學(xué)基金專項(xiàng)：異花授粉調(diào)控梨石細(xì)胞木質(zhì)素合成的分子機(jī)理（項(xiàng)目編號(hào)：31171944）萬方數(shù)據(jù)摘要碭山酥梨(Pyrusbretschneidericv.DangshanSu)原產(chǎn)安徽省碭山縣，栽培歷史悠久，是我國(guó)主要的梨出口品種。近幾年來，由于氣候變化、栽培管理粗放等原因，梨果實(shí)中石細(xì)胞含量增

4、加，影響其食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。梨果實(shí)中石細(xì)胞是一種厚壁組織細(xì)胞，是次生壁在初生壁上沉積形成的，與木質(zhì)素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積均密切相關(guān)。咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，主要參與S-木質(zhì)素的合成。碭山酥梨果實(shí)COMT基因的克隆，目前未見報(bào)道。因此，克隆和鑒定碭山酥梨果實(shí)中COMT基因，探討COMT的分子特性，對(duì)利用分子生物學(xué)技術(shù)調(diào)控梨木質(zhì)素的合成和石細(xì)胞的發(fā)育意義重大。本研究以碭山酥梨果實(shí)為材料，克隆其COMTcDNA全長(zhǎng)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行原核表達(dá)和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，另外還成功構(gòu)建了真核

5、表達(dá)載體，為后期蛋白定位和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.利用RT-PCR技術(shù)并結(jié)合RACE方法得到碭山酥梨咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為PbCOMT，GenBank登錄號(hào)為KC905086。PbCOMT基因全長(zhǎng)1371bp，其開放閱讀框?yàn)?098bp，編碼365個(gè)氨基酸。2.生物信息學(xué)分析結(jié)果為：PbCOMT蛋白的理論分子量約為40KD，理論等電點(diǎn)為5.61。PbCOMT氨基酸序列與蘋果的COMT氨基酸同源性最高，相似性達(dá)94%。PbCOMT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有34.25%α螺旋

6、，16.44%伸展鏈，49.32%的無規(guī)則卷曲。PbCOMT蛋白為疏水性蛋白，其N端無信號(hào)肽，說明該蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，屬于非分泌性蛋白。PbCOMT蛋白的N末端有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)二聚作用的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了催化SAM的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。3.將該基因重組到表達(dá)載體pET-32a(+)中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)表明，PbCOMT基因能在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，電泳檢測(cè)到一條大約60KD的外源蛋白，與預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符。4.實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期(23d，

7、39d，47d，63d和125d)碭山酥梨果實(shí)PbCOMT基因表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在63d時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量?；ê?7dPbCOMT基因表達(dá)量，果中部＞近果核＞近果皮，并且果中部明顯高于近果皮和近果核；而63dPbCOMT基因表達(dá)量，近果核＞近果皮＞果中部。5.以pCAMBIA1301-EGFP為真核載體質(zhì)粒，成功構(gòu)建了1301-PbCOMT-EGFP融合表達(dá)載體并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。關(guān)鍵詞：碭山酥梨，PbCOMT，生物信息學(xué)分析,原核表達(dá)，熒光定量表達(dá)I萬方數(shù)據(jù)AbstractPyrusbretschn

8、eidericv.DangshanSu,whichoriginatedinDangshaninAnhuiProvince,China,hasalongcultivationhistoryandremainsthemainexportproductofthisregion.However,thelocaleconomyassociatedwiththisfruitisund