蔓荊子總黃酮對nci-h446細胞系肺癌干細胞特性的影響

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1、分類號學(xué)校代碼10542密級——學(xué)號2Q!!Q2191621蔓荊子總黃酮對NCI．H446細胞系肺癌干細胞特性的影響EffectsofFructusViticisTotalFlavonoidsoncharacteristicsoflungcancerstemcellsderivedfromNCI．H446cell1ine研究生姓名萱睦邀指導(dǎo)教師姓名、職稱壘翌笠型塾撞學(xué)科專業(yè)生墊堂研究方向墊壁查基簽鎣塹筮絲盈笠旦機靠IJ研究湖南師范大學(xué)學(xué)位評定委員會辦公室二零一四年五月11摘要目的：研究蔓荊子總黃酮(FructusViticisTotalFl

2、avonoids，F(xiàn)VTF)對人小細胞肺癌NCI．H446細胞系肺癌干細胞(1ungcancerstemcells，LCSCs、)自我更新、增殖和侵襲等特性的影響，并探討其潛在作用機制，為研發(fā)能根治小細胞肺癌藥物提供實驗依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)人小細胞肺癌NCI．H446細胞系細胞。采用CDl33免疫磁珠分選法和干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法分選和擴增CDl33+球形成細胞。藻紅蛋白(PE)熒光標記CDl33抗體流式細胞術(shù)分析CDl33陽性細胞百分率。光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)。四甲基偶氮噻唑藍(MTT)L匕色法檢測細胞增殖活性。腫瘤球形成試驗、Tra

3、nswell小室細胞侵襲試驗、裸鼠皮下成瘤實驗和westernblot分析腫瘤干細胞標志物(CD44和ALDHl)、自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Bmil、Nanog和OCT4)和侵襲相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Twistl和Snail)蛋白表達水平。鑒別NCI．H446細胞系CDl33+球形成細胞是否具有LCSCs特性以及不同濃度FVTF(0．5、1．O、2．0gg／mL)作用對LCSCs特性的影響。通過比較LCSCs和親本細胞干細胞標志物(CDl33、CD44、ALDHl)、磷酸化Akt、自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Bmil、Nanog和OCT4)禾13侵襲相關(guān)轉(zhuǎn)

4、錄因子(Twistl和Snail)蛋白表達狀態(tài)，檢測不同濃度FVTF(0．5、1．0、2．0gg／mL)處理對LCSCs上述蛋白表達的影響，并考察P13K特異性抑制劑LY294002(5．0、10．0、20．OgM)或兩者聯(lián)合處理調(diào)控LCSCs上述蛋白表達和抑制LCSCs特性作用，探討FVⅡ通過降低細胞Akt蛋白磷酸化水平，進而下調(diào)CDl33、CD44、ALDHl、Bmil、Nanog、OCT4Twistl和Snail蛋白表達，發(fā)揮抑制LCSCs功能和特性作用的可能機制。結(jié)果：1．CDl33免疫磁珠分選得到的源自人肺癌NCI．H446細胞系

5、CDl33+細胞純度高(CDl33+細胞群：91．85士2．17％wCDl33。細胞群：0．03+0．01％，P

6、錄因子(Twistl和Snail)高表達；具有二次傳代成球生長和單個細胞形成新肺癌球體能力；具有更高侵襲能力(CDl33+球形成細胞：384+43／5000細胞w親本細胞：237+28／5000細胞，P<0．05)。1×103個CDl33+球形成細胞就足夠在Balb／c．nu小鼠皮下形成腫瘤(4／6)，然而，在相應(yīng)的同一模型下至少lxl05個親本細胞才能穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤形成(3／6)，此外，成瘤的時間長短亦有很大的差另Ij(CDl33+球形成細胞：18天w親本細胞：31天)。2．MTT比色法測定結(jié)果表明，F(xiàn)VTF相對選擇性抑制LCSCs增殖活1

7、Ifl!(IC50值，CDl33+球形成細胞：0．7gg／mLVS親本細胞：33．7gg／mL，P

8、05)。3．Westernblot分析結(jié)果證明：LY294002以濃度依賴方式降低LCSCs細胞Akt磷酸化水平儼