蔓荊子總黃酮對(duì)nci-h446細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞特性的影響

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1、分類(lèi)號(hào)學(xué)校代碼10542密級(jí)——學(xué)號(hào)2Q!!Q2191621蔓荊子總黃酮對(duì)NCI．H446細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞特性的影響EffectsofFructusViticisTotalFlavonoidsoncharacteristicsoflungcancerstemcellsderivedfromNCI．H446cell1ine研究生姓名萱睦邀指導(dǎo)教師姓名、職稱(chēng)壘翌笠型塾撞學(xué)科專(zhuān)業(yè)生墊堂研究方向墊壁查基簽鎣塹筮絲盈笠旦機(jī)靠IJ研究湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二零一四年五月11摘要目的：研究蔓荊子總黃酮(FructusViticisTotalFl

2、avonoids，F(xiàn)VTF)對(duì)人小細(xì)胞肺癌NCI．H446細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞(1ungcancerstemcells，LCSCs、)自我更新、增殖和侵襲等特性的影響，并探討其潛在作用機(jī)制，為研發(fā)能根治小細(xì)胞肺癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)人小細(xì)胞肺癌NCI．H446細(xì)胞系細(xì)胞。采用CDl33免疫磁珠分選法和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法分選和擴(kuò)增CDl33+球形成細(xì)胞。藻紅蛋白(PE)熒光標(biāo)記CDl33抗體流式細(xì)胞術(shù)分析CDl33陽(yáng)性細(xì)胞百分率。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)L匕色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。腫瘤球形成試驗(yàn)、Tra

3、nswell小室細(xì)胞侵襲試驗(yàn)、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)和westernblot分析腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物(CD44和ALDHl)、自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Bmil、Nanog和OCT4)和侵襲相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Twistl和Snail)蛋白表達(dá)水平。鑒別NCI．H446細(xì)胞系CDl33+球形成細(xì)胞是否具有LCSCs特性以及不同濃度FVTF(0．5、1．O、2．0gg／mL)作用對(duì)LCSCs特性的影響。通過(guò)比較LCSCs和親本細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物(CDl33、CD44、ALDHl)、磷酸化Akt、自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Bmil、Nanog和OCT4)禾13侵襲相關(guān)轉(zhuǎn)

4、錄因子(Twistl和Snail)蛋白表達(dá)狀態(tài)，檢測(cè)不同濃度FVTF(0．5、1．0、2．0gg／mL)處理對(duì)LCSCs上述蛋白表達(dá)的影響，并考察P13K特異性抑制劑LY294002(5．0、10．0、20．OgM)或兩者聯(lián)合處理調(diào)控LCSCs上述蛋白表達(dá)和抑制LCSCs特性作用，探討FVⅡ通過(guò)降低細(xì)胞Akt蛋白磷酸化水平，進(jìn)而下調(diào)CDl33、CD44、ALDHl、Bmil、Nanog、OCT4Twistl和Snail蛋白表達(dá)，發(fā)揮抑制LCSCs功能和特性作用的可能機(jī)制。結(jié)果：1．CDl33免疫磁珠分選得到的源自人肺癌NCI．H446細(xì)胞系

5、CDl33+細(xì)胞純度高(CDl33+細(xì)胞群：91．85士2．17％wCDl33。細(xì)胞群：0．03+0．01％，P

6、錄因子(Twistl和Snail)高表達(dá)；具有二次傳代成球生長(zhǎng)和單個(gè)細(xì)胞形成新肺癌球體能力；具有更高侵襲能力(CDl33+球形成細(xì)胞：384+43／5000細(xì)胞w親本細(xì)胞：237+28／5000細(xì)胞，P<0．05)。1×103個(gè)CDl33+球形成細(xì)胞就足夠在Balb／c．nu小鼠皮下形成腫瘤(4／6)，然而，在相應(yīng)的同一模型下至少lxl05個(gè)親本細(xì)胞才能穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤形成(3／6)，此外，成瘤的時(shí)間長(zhǎng)短亦有很大的差另Ij(CDl33+球形成細(xì)胞：18天w親本細(xì)胞：31天)。2．MTT比色法測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)VTF相對(duì)選擇性抑制LCSCs增殖活1

7、Ifl!(IC50值，CDl33+球形成細(xì)胞：0．7gg／mLVS親本細(xì)胞：33．7gg／mL，P

8、05)。3．Westernblot分析結(jié)果證明：LY294002以濃度依賴(lài)方式降低LCSCs細(xì)胞Akt磷酸化水平儼