人白介素24cDNA克隆、突變糾正和原核表達(dá)

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1、人白介素24cDNA克隆、突變糾正和原核表達(dá)作者：魏麗麗，李成華，袁成福，陳濟(jì)，丁嵩濤，劉革力，易發(fā)平，宋方洲【摘要】目的獲取人白介素24(IL24)cDNA，構(gòu)建原核表達(dá)載體以表達(dá)含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白GSTIL24。方法以人外周血單核細(xì)胞(PBMC)總RNA為模板，RTPCR擴(kuò)增IL24cDNA，克隆入原核表達(dá)載體pGEX4T2，測序結(jié)果顯示在IL24cDNA第223位G→A，370位T→C，從而導(dǎo)致其編碼蛋白的氨基酸發(fā)生改變：A75T，H124Y，通過二次PCR將其糾正，重組載體pGEXIL24轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2

2、1(DE3)，異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE，Westernblot檢測顯示有融合蛋白GSTIL24表達(dá)。結(jié)果通過RTPCR及二次PCR得到人IL24cDNA，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在相對(duì)分子量約為50000處有融合蛋白表達(dá)。結(jié)論IL24的重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)可以表達(dá)GSTIL24融合蛋白。【關(guān)鍵詞】白介素24；二次PCR；突變糾正；融合蛋白；克??；原核表達(dá)白細(xì)胞介素24(interleukin24,IL1024)是1995年由美國哥倫比亞大學(xué)的Jiang等[1]研究發(fā)現(xiàn)的，

3、它能選擇性地抑制廣譜癌細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡，并具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。經(jīng)復(fù)制缺陷腺病毒攜帶的IL24已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，研究結(jié)果顯示：療效顯著而毒副作用很少[2]。因此，IL24有望成為腫瘤基因治療的一種新的候選基因。我們擬通過RTPCR方法獲取IL24cDNA，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)其表達(dá)，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料　　大腸桿菌E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)為本室保存。pGEX4T2(4970bp)購自Amersham公司。淋巴細(xì)胞分離液購自鼎國公司。Trizol，BamHⅠ，XhoⅠ，

4、pyrobestTMDNApolymerase，DNA連接試劑盒,引物的合成和重組質(zhì)粒測序由TaKaRa公司完成。RT試劑盒購自TOYOBO公司。DNAmarker、小量質(zhì)粒純化抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker購自博大泰克公司?？构入赘孰腟轉(zhuǎn)移酶(glutathioneStransferase,GST)抗體及其二抗購自Merck公司。　　1.2IL24的基因克隆10　　通過淋巴細(xì)胞分離液分離健康人靜脈血的外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，用Trizo

5、l提取其總RNA,通過RTPCR擴(kuò)增IL24cDNA，RT反應(yīng)體系：2μLRNA，1μLoligdT(20)，9μLRNasefreeddH2O70℃5min，冰浴10min，再加入4μL5×RTbuffer，2μLdNTPs，1μLRNaseinhibitor，1μL莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukaemiavirus,MMuLV)反轉(zhuǎn)錄酶30℃10min，42℃20min，99℃10min。根據(jù)GenBank中人IL24基因序列(登錄號(hào)：NM006850)通過DNAStar軟件設(shè)計(jì)IL24引物，并在引物的5′端引入酶切

6、位點(diǎn)，上游引物a：5′CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3′，下游引物b：5′CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3′(劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn))，管家基因G3PDH(glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase)引物序列：PrimerR：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′；PrimerF：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，擴(kuò)出的片段長450bp。PCR反應(yīng)體系：ddH2O8.4μL，10×PCRbuffer2μ

7、L,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL，引物a、b各2μL，PrimerR、F各0.4μL，cDNA3μL，DNA聚合酶0.2μL，94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min(30)，72℃10min。　　1.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建　　將PCR產(chǎn)物和pGEX4T2載體分別用BamHⅠ/XhoⅠ10雙酶切，膠回收試劑盒純化，TaKaRa連接試劑盒連接16℃30min，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，酶切鑒定，將陽性克隆送TaKaRa公司測序?！　?.4IL24cDNA點(diǎn)突變的糾正　　223位G突變?yōu)锳，設(shè)計(jì)其糾正引物c、d；370

8、位T突變?yōu)镃，設(shè)計(jì)其糾正引物e、f,c：5′TCTTTCACAGC