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《過(guò)表達(dá)bclx1的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文過(guò)表達(dá)bcl-x1的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王芙蓉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：張?zhí)K明2003.4.1豐一r甘t土學(xué)■舜‘學(xué)克2003■■士●t蠢文過(guò)表達(dá)矗c卜x1的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究摘要，l隨著對(duì)腦缺St研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到缺血性腦損害后缺St區(qū)域內(nèi)細(xì))9缸壞死，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞DNA損傷相對(duì)集中的區(qū)域由中心向外周分布開來(lái)。近年來(lái)，腦科學(xué)研究者主要致力于干預(yù)細(xì)胞凋亡及DNA損傷來(lái)最大限度地減少神經(jīng)元丟失。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡，一旦啟動(dòng)，則不可逆。對(duì)細(xì)胞凋
2、亡的研究已經(jīng)證明，caspases的蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)控制著凋亡的發(fā)生與發(fā)展。該級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)主要有兩條途徑：一為線粒體依賴途徑，指DNA損傷可促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，在ATP或dATP存在下，細(xì)胞色素C使凋亡蛋白酶活化因子一1(Apaf-1)發(fā)生構(gòu)象變化而活化，活化的Apaf-1促使procaspase．9自身活化，然后再激活下游的caspase．3，．切割特定的凋亡底物，誘發(fā)細(xì)胞凋亡；另一條為死亡受體途徑，是指能與特異配基結(jié)合的死亡受體Fas、TNFRI、DR3、DR4或DtL5，經(jīng)接頭蛋白介導(dǎo)，級(jí)聯(lián)caspase．1、．6、．8或．10，活化下游的效
3、應(yīng)酶caspase．2、．3、一7等，誘發(fā)凋亡反應(yīng)。在抗凋亡的基因簇中，bcl一2基因起著重要作用。Bcl．xl基因?qū)儆赽cl．2基因家族，主要表達(dá)于線粒體內(nèi)膜，核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血及再灌注損傷中，bcl．xl基因起著重要的腦保護(hù)作用。有學(xué)者提出，通過(guò)調(diào)控抗凋亡基因的表達(dá)來(lái)治療腦梗塞是未來(lái)分子水平治療的一種新的方向。自本世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得單個(gè)特定的基因能整合進(jìn)研究對(duì)象的基因組，從而能在生物個(gè)體的整體水平來(lái)觀察某一基因的生理、病理作用，這是以前在細(xì)胞水平研究基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)所不可能達(dá)到的水平，也是真正從整體上、活體的、
4、系統(tǒng)的來(lái)觀察基因的行為，目前，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究應(yīng)用非常廣泛，因而大大拓寬了生物領(lǐng)域的研究范圍。從基礎(chǔ)理論到應(yīng)用技術(shù)，從實(shí)驗(yàn)室到社會(huì)化生產(chǎn)均有了很大的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因的方法主要有：顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載年．r．
5、t太蠢一許‘膏虎2003■■士霹t{分文—————————————————————————————————————一體法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法，電脈沖介導(dǎo)法、磷酸鈣介導(dǎo)法、精子載體法等。由于顯微注射法得到子代動(dòng)物的外源基因攜帶率和表走勢(shì)都較高，而此種方法相對(duì)較成熟，并被大家廣泛接受，因而最常被采用。／本課題擬采用顯微注射法產(chǎn)生過(guò)表達(dá)bcl—xl基因的轉(zhuǎn)基
6、因小鼠，結(jié)合小鼠局灶性腦缺血模型，并利用多種分子生物學(xué)技術(shù)、TUNEL及免疫組化，觀察過(guò)表達(dá)bcl—xl基因在缺血性腦損傷中所發(fā)揮的作用，探索bcl—xl基因與DNA損傷及細(xì)胞凋亡的內(nèi)在關(guān)系，研究bcl．xl作用發(fā)生的機(jī)制，從而尋求在分子水平可能的腦保護(hù)措施。／研究方法‘一1．構(gòu)建bcl—xl的表達(dá)質(zhì)粒，并將其純化及線性化，利用顯微注射法將其注射入受精卵中，將注射后的受精卵移植入假孕鼠的輸卵管中，生出bcl．xl轉(zhuǎn)基因小鼠。用PCR及southern-blot檢測(cè)子代小鼠中bcl-xl基因在小鼠基因組中的整合，用RT-PCR檢測(cè)bcl．xlmRNA的轉(zhuǎn)錄
7、，用Western．blot檢測(cè)bcl．xl蛋白質(zhì)的表達(dá)，鑒定其是否為bcl．x1基因過(guò)表達(dá)的合格的轉(zhuǎn)基因小鼠。2．將檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠作為首建者，采用陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠與正常的昆明白小鼠交配繁殖傳代方法，保持其雜合子形式，避免因近交繁殖易帶來(lái)的近交衰退以及繁殖能力下降等問(wèn)題。然后進(jìn)行PCR及Southern．blot檢測(cè)以了解子代中外源基因的整合情況，用RT-PCR及Western．blot方法半定量研究各系列轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，觀察外源基因的復(fù)制和傳代的穩(wěn)定性。同時(shí)，用RT-PCR方法半定量檢測(cè)了人bcl-xl基因在轉(zhuǎn)基因小鼠腦、肝、
8、腎臟和骨骼肌中的表達(dá)情況，GAPDH被用來(lái)作為內(nèi)參照。3．選擇BALB／c和昆明白兩種小鼠，同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行線栓，同時(shí)觀察小鼠品系、小鼠體重、線栓粗細(xì)、以及術(shù)后溫度對(duì)小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和梗塞體積的影響，以期建立穩(wěn)定的、可重復(fù)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。4．將轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠同時(shí)行線栓永久性阻塞大腦中動(dòng)脈，在缺血24h時(shí)測(cè)其神經(jīng)功能評(píng)分，觀察轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的差別。在缺血后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)其梗塞體積，觀察梗塞體積的動(dòng)態(tài)變化。用TUNEL法觀察小鼠的腦組織2弗-r．}藏土曩一許‘掌屯2003●尊士季t魯文—————————————————————————————
9、—一缺敷后不同時(shí)間點(diǎn)再灌注時(shí)凋亡細(xì)胞的數(shù)量和分布情況。用免疫緞化方法觀察梗塞前后
