資源描述：
《過表達bclx1的轉(zhuǎn)基因小鼠對缺血性腦損傷的保護作用的實驗研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文過表達bcl-x1的轉(zhuǎn)基因小鼠對缺血性腦損傷的保護作用的實驗研究姓名：王芙蓉申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：張?zhí)K明2003.4.1豐一r甘t土學(xué)■舜‘學(xué)克2003■■士●t蠢文過表達矗c卜x1的轉(zhuǎn)基因小鼠對缺血性腦損傷的保護作用的實驗研究摘要，l隨著對腦缺St研究的不斷深入，人們逐漸認識到缺血性腦損害后缺St區(qū)域內(nèi)細)9缸壞死，細胞凋亡，細胞DNA損傷相對集中的區(qū)域由中心向外周分布開來。近年來，腦科學(xué)研究者主要致力于干預(yù)細胞凋亡及DNA損傷來最大限度地減少神經(jīng)元丟失。細胞凋亡是程序性細胞死亡，一旦啟動，則不可逆。對細胞凋
2、亡的研究已經(jīng)證明，caspases的蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)控制著凋亡的發(fā)生與發(fā)展。該級聯(lián)激活反應(yīng)主要有兩條途徑：一為線粒體依賴途徑，指DNA損傷可促使線粒體釋放細胞色素C，在ATP或dATP存在下，細胞色素C使凋亡蛋白酶活化因子一1(Apaf-1)發(fā)生構(gòu)象變化而活化，活化的Apaf-1促使procaspase．9自身活化，然后再激活下游的caspase．3，．切割特定的凋亡底物，誘發(fā)細胞凋亡；另一條為死亡受體途徑，是指能與特異配基結(jié)合的死亡受體Fas、TNFRI、DR3、DR4或DtL5，經(jīng)接頭蛋白介導(dǎo)，級聯(lián)caspase．1、．6、．8或．10，活化下游的效
3、應(yīng)酶caspase．2、．3、一7等，誘發(fā)凋亡反應(yīng)。在抗凋亡的基因簇中，bcl一2基因起著重要作用。Bcl．xl基因?qū)儆赽cl．2基因家族，主要表達于線粒體內(nèi)膜，核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血及再灌注損傷中，bcl．xl基因起著重要的腦保護作用。有學(xué)者提出，通過調(diào)控抗凋亡基因的表達來治療腦梗塞是未來分子水平治療的一種新的方向。自本世紀80年代發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得單個特定的基因能整合進研究對象的基因組，從而能在生物個體的整體水平來觀察某一基因的生理、病理作用，這是以前在細胞水平研究基因轉(zhuǎn)染、表達所不可能達到的水平，也是真正從整體上、活體的、
4、系統(tǒng)的來觀察基因的行為，目前，轉(zhuǎn)基因動物的研究應(yīng)用非常廣泛，因而大大拓寬了生物領(lǐng)域的研究范圍。從基礎(chǔ)理論到應(yīng)用技術(shù)，從實驗室到社會化生產(chǎn)均有了很大的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因的方法主要有：顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載年．r．
5、t太蠢一許‘膏虎2003■■士霹t{分文—————————————————————————————————————一體法、胚胎干細胞介導(dǎo)法，電脈沖介導(dǎo)法、磷酸鈣介導(dǎo)法、精子載體法等。由于顯微注射法得到子代動物的外源基因攜帶率和表走勢都較高，而此種方法相對較成熟，并被大家廣泛接受，因而最常被采用。／本課題擬采用顯微注射法產(chǎn)生過表達bcl—xl基因的轉(zhuǎn)基
6、因小鼠，結(jié)合小鼠局灶性腦缺血模型，并利用多種分子生物學(xué)技術(shù)、TUNEL及免疫組化，觀察過表達bcl—xl基因在缺血性腦損傷中所發(fā)揮的作用，探索bcl—xl基因與DNA損傷及細胞凋亡的內(nèi)在關(guān)系，研究bcl．xl作用發(fā)生的機制，從而尋求在分子水平可能的腦保護措施。／研究方法‘一1．構(gòu)建bcl—xl的表達質(zhì)粒，并將其純化及線性化，利用顯微注射法將其注射入受精卵中，將注射后的受精卵移植入假孕鼠的輸卵管中，生出bcl．xl轉(zhuǎn)基因小鼠。用PCR及southern-blot檢測子代小鼠中bcl-xl基因在小鼠基因組中的整合，用RT-PCR檢測bcl．xlmRNA的轉(zhuǎn)錄
7、，用Western．blot檢測bcl．xl蛋白質(zhì)的表達，鑒定其是否為bcl．x1基因過表達的合格的轉(zhuǎn)基因小鼠。2．將檢測獲得的轉(zhuǎn)基因陽性鼠作為首建者，采用陽性轉(zhuǎn)基因小鼠與正常的昆明白小鼠交配繁殖傳代方法，保持其雜合子形式，避免因近交繁殖易帶來的近交衰退以及繁殖能力下降等問題。然后進行PCR及Southern．blot檢測以了解子代中外源基因的整合情況，用RT-PCR及Western．blot方法半定量研究各系列轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達情況，觀察外源基因的復(fù)制和傳代的穩(wěn)定性。同時，用RT-PCR方法半定量檢測了人bcl-xl基因在轉(zhuǎn)基因小鼠腦、肝、
8、腎臟和骨骼肌中的表達情況，GAPDH被用來作為內(nèi)參照。3．選擇BALB／c和昆明白兩種小鼠，同時對它們進行線栓，同時觀察小鼠品系、小鼠體重、線栓粗細、以及術(shù)后溫度對小鼠的神經(jīng)功能評分和梗塞體積的影響，以期建立穩(wěn)定的、可重復(fù)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。4．將轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠同時行線栓永久性阻塞大腦中動脈，在缺血24h時測其神經(jīng)功能評分，觀察轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的差別。在缺血后不同時間點測其梗塞體積，觀察梗塞體積的動態(tài)變化。用TUNEL法觀察小鼠的腦組織2弗-r．}藏土曩一許‘掌屯2003●尊士季t魯文—————————————————————————————
9、—一缺敷后不同時間點再灌注時凋亡細胞的數(shù)量和分布情況。用免疫緞化方法觀察梗塞前后
