豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷ELISA方法的建立

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1、分類號(hào)：S855.3單位代碼：10183研究生學(xué)號(hào)：2016854021密級(jí)：公開豬偽狂犬病毒野毒吉林大學(xué)感染與碩士學(xué)位論文疫苗免（專業(yè)學(xué)位）疫鑒豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷ELISA方法的建立別診DevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfrom斷ELvaccinatedanimalsofPRVISA方作者姓名：王楊法的專業(yè)：獸醫(yī)碩士建立研究方向：獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)王指導(dǎo)教師：叢彥龍教授楊合作指導(dǎo)教師：趙榮茂博士吉培養(yǎng)單位：動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院林大2018年06月學(xué)豬偽狂犬病

2、毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷ELISA方法的建立DevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV作者姓名：王楊專業(yè)名稱：獸醫(yī)碩士指導(dǎo)教師：叢彥龍教授合作指導(dǎo)教師：趙榮茂博士學(xué)位類別：碩士論文答辯日期：2018年6月5日未經(jīng)本論文作者的書面授權(quán)，依法收存和保管本論文書面版本、電子版本的任何單位和個(gè)人，均不得對(duì)本論文的全部或部分內(nèi)容進(jìn)行任何形式的復(fù)制、修改、發(fā)行、出租、改編等有礙作者著作權(quán)的商業(yè)性使用（但純學(xué)術(shù)性使用不在此限）。否則

3、，應(yīng)承擔(dān)侵權(quán)的法律責(zé)任。吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交學(xué)位論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》投稿聲明研究生院：本人同意《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》出版章程的內(nèi)容，愿意將本人的學(xué)位論文委托研究生院向中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電

4、子雜志社的《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》投稿，希望《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》給予出版，并同意在《中國(guó)博碩士學(xué)位論文評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)》和CNKI系列數(shù)據(jù)庫(kù)中使用，同意按章程規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。論文級(jí)別：■碩士□博士學(xué)科專業(yè)：獸醫(yī)論文題目：豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷ELISA方法的建立作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：年月日作者聯(lián)系地址（郵編）：吉林省長(zhǎng)春市綠園區(qū)西安大路5333號(hào)吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院（130062）作者聯(lián)系電話：15718843418中文摘要豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷ELISA方法的建立豬偽狂犬

5、病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）主要經(jīng)消化道、呼吸道、空氣及胎盤等進(jìn)行傳播。病毒感染后，豬可能終生帶毒并持久排毒，目前尚無(wú)有效治療藥物，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2011年底，我國(guó)山東、河南、河北等多個(gè)免疫了某PRV疫苗的豬場(chǎng)暴發(fā)了疑似PR的疫病，發(fā)病豬出現(xiàn)高溫（40～42℃）、咳嗽、腹瀉并伴隨有系統(tǒng)性神經(jīng)癥狀，新生仔豬死亡率高。病毒分離結(jié)果表明，引起此次發(fā)病的病原體是變異的PRV，這對(duì)偽狂犬病（Pseudorabies，PR）的防控提出了新的挑戰(zhàn)。PRV基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，其中g(shù)E蛋白是PRV主要的毒力

6、因子，在病毒跨神經(jīng)元傳播過(guò)程中發(fā)揮重要作用。以gE蛋白為靶點(diǎn)鑒別野毒感染與疫苗免疫的優(yōu)勢(shì)在于gE基因具有高度的保守性，表達(dá)于所有野毒株，并且gE糖蛋白抗體產(chǎn)生迅速且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因此被用來(lái)作為PRV野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷的首選靶標(biāo)。目前大部分商品化的PRV弱毒疫苗和滅活疫苗均缺失gE基因，由于野毒感染豬的存在，單純使用疫苗并不能根除PRV。因此，在PRV凈化過(guò)程中，結(jié)合野毒感染豬與疫苗免疫豬的鑒別診斷方法，堅(jiān)決淘汰PRV野毒感染豬是根除PR的根本措施。目前，我國(guó)主要依賴國(guó)外昂貴的試劑盒來(lái)鑒別診斷PRV野毒與疫苗毒。雖然國(guó)內(nèi)一些

7、公司也有PRV檢測(cè)的同類試劑盒，但效果較國(guó)外進(jìn)口有一定差距。因此，有必要研發(fā)能準(zhǔn)確鑒別PRV野毒感染與疫苗免疫的國(guó)產(chǎn)試劑盒。為建立PRV抗體檢測(cè)間接ELISA方法，本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增出PRVgE基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)片段gE37～243，將其與pET-32a(+)載體進(jìn)行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)蛋白表達(dá)條件優(yōu)化，獲得可溶性表達(dá)的gE37～243蛋白。利用Ni-NTA親和層析純化的gE37～243蛋白免疫小鼠，經(jīng)過(guò)辛酸硫酸銨純化獲得了2株P(guān)RV的單克隆抗體，以I期為PRV單抗阻斷ELISA方法的建立奠定基礎(chǔ)。利用純化的gE37～243

8、蛋白作為包被抗原建立了PRV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法，并對(duì)抗原包被條件、血清稀釋液、封閉液、一抗，二抗工作濃度、作用時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)與商品化試劑盒進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，本研究所建立的ELISA方法的敏感性為93.33%，特異性為93.75%，批內(nèi)以及批間變異系數(shù)