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《抗植物毒素Pro.R單域抗體的五聚體構(gòu)建、表達(dá)及生物活性鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文抗植物毒素Pro.R單域抗體的五聚體構(gòu)建、表達(dá)及生物活性鑒定生物技術(shù)03-2李阿茜指導(dǎo)老師閻錫蘊(yùn)張德強(qiáng)摘要目的：建立單域抗體多聚化的技術(shù)平臺(tái)，提高其與抗原的親和力，以期實(shí)現(xiàn)單域抗體對(duì)毒素的高靈敏檢測(cè)。方法和結(jié)果：從質(zhì)粒pCANTAB5ES1中PCR擴(kuò)增出特異識(shí)別植物毒素Pro.R的單域抗體S1的基因，亞克隆到五聚體載體pVT2中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVT2S1，再轉(zhuǎn)化到E.coliTG1中。經(jīng)westernblot鑒定了其正確表達(dá)，IPTG大量誘導(dǎo)后通過Ni-his親和層析純化，300mM咪唑溶液冼脫蛋白，獲得了高表達(dá)的可溶性目的蛋白——pVT2S1。SDS—PAGE
2、分析顯示表達(dá)的蛋白區(qū)帶分子量約22kDa左右，與預(yù)期相符。ELISA結(jié)果表明，純化的pVT2S1蛋白可特異性識(shí)別抗原Pro.R。由于pVT2載體上為5×his標(biāo)簽，與常用表達(dá)載體上6×his標(biāo)簽檢測(cè)系統(tǒng)不同，為了統(tǒng)一單體VHH和五聚體VHH的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，又進(jìn)行了載體的改造，分別構(gòu)建了pVT2S1（6×his）、空載體pVT2（6×his）和pETS1(單域抗體，N端為6×his標(biāo)簽),這些都為進(jìn)一步研究VHH抗體的生物活性以及實(shí)際應(yīng)用，如抗原的檢測(cè)等奠定了較好的基礎(chǔ)。結(jié)論：成功建立單域抗體多聚化的技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了載體的統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為高靈敏度檢測(cè)毒素Pro.R奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：Pro.R，單
3、域抗體，五聚體載體1北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文ConstructionofpentamerizedsingledomainantibodyagainsttoxinPro.RandidentificationofitsbindingactivityBiologyscienceandtechnology03-2AQian-LiSupervisorXiYun-YanDeQiang-ZhangAbstractObjective：SettingupaplatformforscreeningVHHantibody（variabledomainofheavychainofheavychainantibod
4、y）,improvingtheaffinityofVHH,anddetectionthetoxininahighsensitivity.Methodsandresults：ThegeneofVHHS1thatspecificallyrecognizesplanttoxinPro.RwasamplifiedbyPCRfromplasmidpCANTAB5ES1.TheamplifiedfragmentswereclonedintopentamerizationvectorpVT2,andtherecombinantplasmidpVT2S1wastransformedintoE.coliTG
5、1.Afteridentificationofitsexpressionbywesternblot,TG1/pVT2S1wasinducedwithIPTG.ThetargetproteinexpressedinE.coliwaspurifiedbyNi2+Affinitychromatography（300mMimidizoneelution）.SoweobtainedsolubleexpressiontargetproteinpVT2S1athighlevel.TheactivityofpurifiedtargetproteinpVT2S1wasidentifiedbyELISA.Th
6、ereisa5×histagonvectorpVT2,whileonnormalvectorsthereisa6×histag.ToconformthetestingstandardofpentavalentVHHandmonovalentVHH,wereconstructedvectors：pVT2S1（6×his）、freevectorpVT（26×his）andpETS1（monomerVHHwitha6×histagonNterminal）.AlloftheaboveworkisintendedasabasisforfurtherstudyandapplicationofVHH,s
7、uchastestingofantigen.Conclusion：WehavesuccessfullysetuptheplatformforscreeningVHHantibody,standardizedthedetectiontagofpentamerandmonomer,andestablishedthefoundationoftoxinhighsensitivitydetection.Keywords：Pro.R
