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《抗植物毒素Pro.R單域抗體的五聚體構建、表達及生物活性鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文抗植物毒素Pro.R單域抗體的五聚體構建、表達及生物活性鑒定生物技術03-2李阿茜指導老師閻錫蘊張德強摘要目的：建立單域抗體多聚化的技術平臺，提高其與抗原的親和力，以期實現單域抗體對毒素的高靈敏檢測。方法和結果：從質粒pCANTAB5ES1中PCR擴增出特異識別植物毒素Pro.R的單域抗體S1的基因，亞克隆到五聚體載體pVT2中，構建重組表達質粒pVT2S1，再轉化到E.coliTG1中。經westernblot鑒定了其正確表達，IPTG大量誘導后通過Ni-his親和層析純化，300mM咪唑溶液冼脫蛋白，獲得了高表達的可溶性目的蛋白——pVT2S1。SDS—PAGE
2、分析顯示表達的蛋白區(qū)帶分子量約22kDa左右，與預期相符。ELISA結果表明，純化的pVT2S1蛋白可特異性識別抗原Pro.R。由于pVT2載體上為5×his標簽，與常用表達載體上6×his標簽檢測系統(tǒng)不同，為了統(tǒng)一單體VHH和五聚體VHH的檢測標準，又進行了載體的改造，分別構建了pVT2S1（6×his）、空載體pVT2（6×his）和pETS1(單域抗體，N端為6×his標簽),這些都為進一步研究VHH抗體的生物活性以及實際應用，如抗原的檢測等奠定了較好的基礎。結論：成功建立單域抗體多聚化的技術平臺，實現了載體的統(tǒng)一檢測標準，為高靈敏度檢測毒素Pro.R奠定基礎。關鍵詞：Pro.R，單
3、域抗體，五聚體載體1北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文ConstructionofpentamerizedsingledomainantibodyagainsttoxinPro.RandidentificationofitsbindingactivityBiologyscienceandtechnology03-2AQian-LiSupervisorXiYun-YanDeQiang-ZhangAbstractObjective：SettingupaplatformforscreeningVHHantibody（variabledomainofheavychainofheavychainantibod
4、y）,improvingtheaffinityofVHH,anddetectionthetoxininahighsensitivity.Methodsandresults：ThegeneofVHHS1thatspecificallyrecognizesplanttoxinPro.RwasamplifiedbyPCRfromplasmidpCANTAB5ES1.TheamplifiedfragmentswereclonedintopentamerizationvectorpVT2,andtherecombinantplasmidpVT2S1wastransformedintoE.coliTG
5、1.Afteridentificationofitsexpressionbywesternblot,TG1/pVT2S1wasinducedwithIPTG.ThetargetproteinexpressedinE.coliwaspurifiedbyNi2+Affinitychromatography（300mMimidizoneelution）.SoweobtainedsolubleexpressiontargetproteinpVT2S1athighlevel.TheactivityofpurifiedtargetproteinpVT2S1wasidentifiedbyELISA.Th
6、ereisa5×histagonvectorpVT2,whileonnormalvectorsthereisa6×histag.ToconformthetestingstandardofpentavalentVHHandmonovalentVHH,wereconstructedvectors：pVT2S1（6×his）、freevectorpVT（26×his）andpETS1（monomerVHHwitha6×histagonNterminal）.AlloftheaboveworkisintendedasabasisforfurtherstudyandapplicationofVHH,s
7、uchastestingofantigen.Conclusion：WehavesuccessfullysetuptheplatformforscreeningVHHantibody,standardizedthedetectiontagofpentamerandmonomer,andestablishedthefoundationoftoxinhighsensitivitydetection.Keywords：Pro.R
