稀釋平板計(jì)數(shù)法

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1、稀釋平板計(jì)數(shù)操作方法實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的2—3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操

2、作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)（如活菌制劑），以及食品、飲料和水〔包括水源水〕等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)器材LB液體、固體培養(yǎng)基1m1移液器，平皿，試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1．無(wú)菌器材的準(zhǔn)備(1)無(wú)菌培養(yǎng)皿：取培養(yǎng)皿9套，包扎、滅菌。(2)無(wú)菌水：取6支試管，分別裝入4.5m1蒸餾水，加棉塞，滅菌。2．樣品稀釋液的制備(1)編號(hào)取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6(稀釋度)各3套。另取6支盛

3、有4.5m1無(wú)菌水的試管，依次標(biāo)是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。(2)稀釋用1m1移液器吸取0.5m1己充分混勻的菌懸液(待測(cè)樣品)，至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。用1m1移液器在10-1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸入管底，吹時(shí)離開(kāi)液面?；靹蚝笪?.5ml至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤?lèi)推，整個(gè)過(guò)程如圖所示。3．平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng)有澆注平板培養(yǎng)法和涂布平板培養(yǎng)法兩種方法。(1)澆注

4、平板培養(yǎng)法1)取樣用三支1ml無(wú)菌吸管分別吸取10-4、10-5、和10-6的稀釋菌懸液各1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。2)倒平板盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒人融化后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基約15毫升／平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快

5、倒入融化并己冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。(2)涂布平板計(jì)數(shù)法：平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20—30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置于的恒溫箱中培養(yǎng)24—48h。涂布平板用的菌懸液量一般

6、以0.1ml較為適宜，如果過(guò)少，菌液不易涂布開(kāi)；過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表：稀釋度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu數(shù)/平板每ml中的cfu數(shù)計(jì)數(shù)和報(bào)告1．操作方法：培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì)算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。2．到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過(guò)24h。

7、3．計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板，若有二個(gè)稀釋度均在30~300之間時(shí)，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報(bào)告）。4．若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。有的

8、規(guī)定對(duì)上述幾種情況計(jì)算出的菌落數(shù)按估算值報(bào)告。5．不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板