稀釋平板計數(shù)法

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1、稀釋平板計數(shù)操作方法實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2—3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操

2、作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水〔包括水源水〕等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。實驗器材LB液體、固體培養(yǎng)基1m1移液器，平皿，試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。實驗步驟1．無菌器材的準備(1)無菌培養(yǎng)皿：取培養(yǎng)皿9套，包扎、滅菌。(2)無菌水：取6支試管，分別裝入4.5m1蒸餾水，加棉塞，滅菌。2．樣品稀釋液的制備(1)編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6(稀釋度)各3套。另取6支盛

3、有4.5m1無菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。(2)稀釋用1m1移液器吸取0.5m1己充分混勻的菌懸液(待測樣品)，至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。用1m1移液器在10-1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面?；靹蚝笪?.5ml至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個過程如圖所示。3．平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng)有澆注平板培養(yǎng)法和涂布平板培養(yǎng)法兩種方法。(1)澆注

4、平板培養(yǎng)法1)取樣用三支1ml無菌吸管分別吸取10-4、10-5、和10-6的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。2)倒平板盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒人融化后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基約15毫升／平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應盡快

5、倒入融化并己冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。(2)涂布平板計數(shù)法：平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20—30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置于的恒溫箱中培養(yǎng)24—48h。涂布平板用的菌懸液量一般

6、以0.1ml較為適宜，如果過少，菌液不易涂布開；過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。實驗結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表：稀釋度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu數(shù)/平板每ml中的cfu數(shù)計數(shù)和報告1．操作方法：培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進行報告。2．到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

7、3．計數(shù)時應選取菌落數(shù)在30~300之間的平板，若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。4．若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的

8、規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。5．不同稀釋度的菌落數(shù)應與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板