細菌平板計數法

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1、操作步驟l．編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀釋用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10-1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體

2、外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。??其余依次類推。放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。3.取樣用三支1mL無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅

3、速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5．計數培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5。一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，

4、否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數據統(tǒng)計，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無

5、菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。五、實驗報告1．結果2．將培養(yǎng)后菌落計數結果填入下表2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優(yōu)缺點及應用。(4)當你的

6、平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計數，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結果?實驗一革蘭染色法、細菌的特殊染色法實驗目的：掌握細菌革蘭染色的原理與方法；掌握細菌芽孢染色的基本原理與方法；熟悉普通光學顯微鏡的油鏡使用與保養(yǎng)方法。實驗材料：菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試劑：結晶紫、碘液、95%乙醇、番紅花紅、孔雀綠實驗內容：1、染色過程：涂片（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（結晶紫染色1min）→媒染（碘1min）→水洗→95%乙醇脫色（1min）→復染（番紅花

7、紅染色1min）→干燥→鏡檢（油鏡）2、注意事項：（1）菌種應選用對數期的菌種；（2）涂片不易過厚，涂片薄而均勻為好；（3）脫色不足或脫色過度均會造成革蘭染色的假陽性或假陰性，脫色時間取決于涂片厚度、室溫等。實驗二、芽孢染色芽孢是某些細菌在生長發(fā)育的后期在細胞內形成的圓形或橢圓型的抗逆性比較強的休眠體，是細菌的一種特殊構造。染色過程：涂片（枯草芽孢桿菌）→干燥→固定→初染（孔雀綠染色20-30min）→水洗→復染（番紅花紅染色1min）→干燥→鏡檢注意事項：（1）涂片時，生理鹽水及取菌不宜過多，涂片應盡