《酶分子定向進(jìn)化》PPT課件

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1、酶分子定向進(jìn)化技術(shù)天然酶的應(yīng)用及局限性酶的定向進(jìn)化的思想酶的定向進(jìn)化的策略和方法酶的定向進(jìn)化技術(shù)的展望生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自然界中,并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性,都是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用.酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序,精確而順利地進(jìn)行,幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān),可以這樣說,沒有酶的存在,就沒有生物體的一切生命活動(dòng).天然酶的局限性隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入,研究者發(fā)現(xiàn),酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工

2、業(yè)化應(yīng)用的要求,而且天然酶的穩(wěn)定性差,活性低使催化效率很低,還缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過程.現(xiàn)代生物工程對(duì)酶的要求能具備長期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物進(jìn)一步增強(qiáng)酶對(duì)多種底物的分解能力如何利用相對(duì)簡單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景.1993年,美國科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.定向進(jìn)化定向進(jìn)化是模擬自然進(jìn)化的過程，進(jìn)行人工隨機(jī)突變，并

3、在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇，使進(jìn)化朝著人們所需要的方向發(fā)展的技術(shù)過程。分為分子定向進(jìn)化和細(xì)胞定向進(jìn)化細(xì)胞定向進(jìn)化細(xì)胞定向進(jìn)化是在細(xì)胞水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過程，以各種細(xì)胞為進(jìn)化對(duì)象，目的是改良細(xì)胞的各種特征，主要包括微生物細(xì)胞的定向進(jìn)化、動(dòng)物細(xì)胞的定向進(jìn)化、植物細(xì)胞的定向進(jìn)化等。隨機(jī)突變方法有全基因組重排技術(shù)?；蚪M重排技術(shù)通過把誘變與細(xì)胞融合技術(shù)相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因組重排，從而大幅度增加細(xì)胞的正突變頻率。分子定向進(jìn)化分子定向進(jìn)化是在分子水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過程。分子定向進(jìn)化首先要通過從細(xì)胞內(nèi)提取或者通過PCR等方法獲得目

4、標(biāo)分子的基因，在體外采用易錯(cuò)PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技術(shù)進(jìn)行人工突變，然后進(jìn)行定向選擇而獲得所需突變體。酶分子定向進(jìn)化簡稱酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過程。酶定向進(jìn)化的基本過程隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫、定向選擇酶定向進(jìn)化的基本過程：酶基因隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)突變的策略易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)D

5、NA改組(DNAshuflling):由美國Stemmer于1994年首次提出一項(xiàng)體外重組技術(shù)隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP):由Zhao等提出,是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)基因家族重排技術(shù)酶定向進(jìn)化的特點(diǎn)1適應(yīng)面廣2目的性強(qiáng)3效果顯著第二節(jié)酶基因的隨機(jī)突變體外隨機(jī)突變的方法：PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)基因隨機(jī)突變方法的特點(diǎn)P207表8－1隨機(jī)突變方法可以聯(lián)合使用，交叉進(jìn)行，通過多次試驗(yàn)，反復(fù)篩選，以完成對(duì)酶的定向進(jìn)化。一易錯(cuò)PC

6、R技術(shù)在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過改變反應(yīng)條件，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，就成為易錯(cuò)PCR技術(shù)。可以通過提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變4種底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時(shí)，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。特點(diǎn)正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化。二DNA重排技術(shù)概念：又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿

7、基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。DNA重排技術(shù)的基本過程兩條以上正突變基因DNA隨機(jī)片斷突變基因構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶酶切（反復(fù)進(jìn)行）無引物PCR基因重組酶切DNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因通過脫氧核糖核算酶Ⅰ（DNaseⅠ)等酶的作用，隨機(jī)切割成若干DNA片斷，然后將這些隨機(jī)片斷在不加引物的條件下經(jīng)過多次PCR循環(huán)，使這些DNA隨機(jī)片斷互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增、延伸，再加入適宜的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得全長基因。這些全長基因由于是在不加引物的條件下由DNA隨機(jī)片斷互為模板和引物擴(kuò)增而成的

8、，其堿基序列經(jīng)過重新排布而形成眾多的突變基因。1）交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)：在同一個(gè)反應(yīng)體系中以兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)的DNA片斷為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，把PCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并且大大縮短了反應(yīng)時(shí)間（55℃，5s)。在反應(yīng)過程中，引物先與一個(gè)模板結(jié)合，進(jìn)行延伸，隨之進(jìn)行多次變性和短時(shí)的退火－－延伸反