【精品】核醫(yī)學(xué)體外分析教案-北大

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1、第一節(jié)放射免疫分析一、原理(一)基本原理放射免疫分析(RIA)的基礎(chǔ)是放射性核素標(biāo)記的抗原(radionuclidelabeledantigen)和非標(biāo)記抗原(unlabeledantigen)(標(biāo)準(zhǔn)抗原或被測抗原)同時(shí)與限量的特異性抗體(specificantibody)進(jìn)行競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)(competitiveimmunebindingreaction),其競爭關(guān)系可用下式表示:Ag+Ab<*^Ag-Ab+AgI*AgAV*Ag+*Ag-Ab式中：*Ag為標(biāo)記抗原，Ag為非標(biāo)記抗原，Ab

2、為特異性抗體，*Ag-Ab為標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，Ag-Ab為非標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。由于*Ag與Ag的免疫活性完全相同，對Ab具有同樣的親和力，當(dāng)*人盤和Ab為恒定量，Ag和*人8的總量大于Ab上的有效結(jié)合點(diǎn)時(shí)，*Ag-Ab的形成是隨著Ag量的增加而減少，剩下來的未結(jié)合或游離的*Ag則隨著Ag量的增加而增加，稱為競爭結(jié)合反應(yīng)（competitivebindingreaction）,因此測定*Ag-Ab或*人盤即nJ??????????+?ooooOOOOoooooooooooooooo2S■■■■

3、推出被測的Ag量（圖13-1）o圖13-1放射免疫分析原理示意圖（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B或游離*Ag的放射性F,計(jì)算岀結(jié)合率13%[13/（B+F）X100%]或其他指標(biāo)，如B/Bo%（B°表示不含非標(biāo)記抗原管的最大結(jié)合放射性）。以B%或B/弘%為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫座標(biāo)，繪制曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）（圖13-2）o依同法測得被測樣品的B%或B

4、/Bo%,即可從此標(biāo)準(zhǔn)曲線上杳出樣品中被測抗原的濃度。50XW02550100200400866^025501002（!）04008^6aAi啟度匕“區(qū)度標(biāo)準(zhǔn)曲線a.以B/Bt%為縱康標(biāo)的標(biāo)庭曲蛾b.以為縱冷懷的休廈曲紋e圖13-2標(biāo)準(zhǔn)曲線二、基本條件_(-)特異性抗體1.抗體親和力抗體親和力(antibodyaffinity)是抗體與抗原之間相互作用的一種結(jié)合能力或強(qiáng)度。親和力大即免疫結(jié)合既快又牢固，不易重新解離。kiAg+Ab<>Ag-Ab1<2親和力的人小用親和常數(shù)(affinitycon

5、stant)Ka值來表示，心=ki/k2,一般更求?值在10lo-1012L/M之間。親和常數(shù)憶的計(jì)算最常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)作圖法：即以B/F為縱坐標(biāo)，以[B]為橫坐標(biāo)，得到一條直線，其斜率的負(fù)數(shù)即為K“(圖13-3)o圖13-3標(biāo)準(zhǔn)分析圖親和常數(shù)K“還可利用常規(guī)RIA中的兒個(gè)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算:6XBo%Ka=(1-Bo%)(2—B。％)(4-Bo%)(3ED50-ED^)式中Bo%為零標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率，ED和和E%分別為結(jié)合率為50%和25%時(shí)對應(yīng)劑量，可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上杏得。1.抗體特異性指抗體分別與相應(yīng)

6、抗原和抗原結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合能力的比較?？贵w與相應(yīng)抗原結(jié)合能力強(qiáng)，而與該抗原結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合能力弱，則特界性高。抗體與抗原結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合稱交叉反應(yīng)(crossreaction)。501002004008001600同類物(ng/al)交叉反應(yīng)試臉交叉反應(yīng)率二EDso(B)/EDso(A)X100%(圖13-4)o圖13-4交叉反應(yīng)試驗(yàn)2.抗血清滴度以免疫反應(yīng)屮所需抗血清(antiserum)的稀釋度的倒數(shù)來表示，稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價(jià)越高。在實(shí)際工作中要找出抗血清的最

7、適稀釋度，即與抗原比例最適當(dāng)、檢測抗原特異性最高、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率最大的稀釋度(圖13-5)。100圖13-5抗血清滴度曲線測定方法：將抗血淸稀釋成不同濃度，分別加入恒量標(biāo)記抗原，經(jīng)溫育后分離B、F,求出不同稀釋度的B%,以稀釋度為橫座標(biāo)，B%為縱座標(biāo)，繪制出抗血清滴度Illi線(antiserumtitercurve),一般以B%為30%?50%的抗體稀釋度為最適稀釋度。(―)標(biāo)記抗原對標(biāo)記抗原的要求：1.比活度(specificactivity):比活度越高，靈敏度越高。2.放射化學(xué)純度(rad

8、iochemicalpurity):指具有免疫活性的標(biāo)記抗原的放射性占總放射性的百分率?一般要求大于95%o3.免疫活性：蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記過多的碘原子就可能引起免疫活性的改變，一般以每個(gè)蛋白質(zhì)分子上只標(biāo)1?2個(gè)1251原子為宜。4.穩(wěn)定性。(三)標(biāo)準(zhǔn)品_1.對標(biāo)準(zhǔn)品的要求1.標(biāo)準(zhǔn)品(standard)與被測物應(yīng)屬同一種物質(zhì)2.在與抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，應(yīng)與被測物具有相等的活性和親和力3.高度純化4.定量精確1.標(biāo)準(zhǔn)品的級別國家標(biāo)準(zhǔn)：是高度純化的標(biāo)準(zhǔn)品，并與各國的標(biāo)準(zhǔn)及世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過