QKI蛋白原核表達、純化及其多克隆抗體制備及鑒定

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1、QKI蛋白原核表達、純化及其多克隆抗體制備及鑒定作者：黃博，于芳，王孝功，白麗圓，李華，盧茲凡畢業(yè)論文【關(guān)鍵詞】；QKI畢業(yè)論文［摘要］;目的：獲得原核表達的RNA結(jié)合蛋白QKI7蛋白，并制備其兔抗QKI多克隆抗體。方法：將成功插入QKI7編碼區(qū)cDNA的PET32b(+)原核表達載體用熱休克法轉(zhuǎn)化BL2KDE3)感受態(tài)細菌，以IPTG誘導6XHisQKI7融合蛋白的表達，分別經(jīng)金屬鰲合柱、反向柱和強陰離子交換柱進行層析純化。經(jīng)SDSPAGE和Westernblot鑒定后，應用純化的融合蛋白，分

2、別以弗氏佐劑、聚丙烯酰胺凝膠、NC膜作為佐劑免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，并以Westernblot進行檢測。結(jié)果：；經(jīng)表達并純化的QKI7蛋白純度達到95%以上，應用純化的融合蛋白以弗氏佐劑作為佐劑免疫新西蘭大白兔后獲得高滴度，特異性的抗QKI的多克隆抗體。結(jié)論：成功地表達并純化了QKI7蛋白，并制備了高滴度、高特異性的抗QKI多克隆抗體。采用弗氏佐劑作為免疫佐劑進行免疫的效果優(yōu)于聚丙烯酰胺凝膠和NC膜。畢業(yè)論文［關(guān)鍵詞］QKI7；原核表達；蛋白純化；多克隆抗體畢業(yè)論文QKI是屬于STAR家

3、族的一種RNA結(jié)合蛋白，在進化過程中高度保守，在神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成、胚胎發(fā)育、心血管系統(tǒng)的發(fā)育等方面起著重要的作用。qki基因不同部位的突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙，或于出生后10d表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強直性驚厥的發(fā)作［1-3］。Pilotte等⑷發(fā)現(xiàn)QKI7可以引起成纖維細胞和原代培養(yǎng)的大鼠少突膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，；QKI5和QKI6不但不能誘導凋亡，反而可以與QKI7形成二聚體,并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，抑制QKI7的致凋亡作用。為了研究QKI在外界不同信號刺激下在炎癥

4、發(fā)生、血管生成過程中表達水平的變化，我們表達和純化了6XHisQKI7融合蛋白，并制備了高特異性的多克隆抗體［5］。同時還比較了利用3種不同的免疫佐劑制備QKI多克隆抗體的效果。畢業(yè)論文1;材料和方法畢業(yè)論文1.1；材料；6XHis融合表達載體PET32b(+)QKI7含有編碼QKI7cDNA序列，由美國Emory大學藥理系教授馮越惠贈。Ni金屬鰲合柱(SepharoseFastFlow)、反相層析柱(source30RPC)和強陰離子柱(source30Q)均購自Pharmacia公司。純種新

5、西蘭白兔由本校實驗動物中心提供。弗氏佐劑購自GibcoBRL公司。ITepG2細胞、Hy906細胞為本室保存的引自美國ATCC的標準細胞株。畢業(yè)論文1.2；方法畢業(yè)論文1.2.1；細菌的發(fā)酵和裂解；將6XHis融合表達載體PET32b(+)QKI7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)接到5mL的LB培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接細菌到500mL2XYT培養(yǎng)基中，3CTC培養(yǎng)10h無菌接種于30L發(fā)酵罐中(內(nèi)有8L培養(yǎng)液，不含抗生素)371培養(yǎng)6h后開始流加補料，9h后加入IPTG至終濃度05mmo

6、l/L開始誘導，誘導4h后停止發(fā)酵。4000r/min離心25min,收集沉淀，-7(TC保存?zhèn)溆?。取發(fā)酵細菌，按照細菌和裂解液為1：8的比例加入裂解(20mmol/LTrispH10,3mL/L蔬基乙醇，6mol/L鹽酸肌)，不停攪拌，室溫過夜。8000r/min離心30min,收集上清；然后用超聲波發(fā)生器以1500W的功率超聲，超聲9s間歇15s,—個循環(huán)超聲90次，攻擊超聲5個循環(huán)，待用。畢業(yè)論文1.2.2；親和層析純化QK17；金屬鰲合柱經(jīng)過A液(20mmol/LTrisHClpH80,

7、150mmol/LNaCl,6mol/LW)平衡后，取第一步準備的上清直接采用金屬鰲合柱層析。上樣流速為8mL/min；上樣完成后用A液流洗至基線，直接用B液(20mmol/LTrisHClpH80,150mmol/LNaCl,6mol/L淼，200mmol/L咪呼:)洗脫，收集目的蛋白峰，準備下一步反相層析純化。畢業(yè)論文1.2.3；反相層析純化QKI7；以8mL/min的流速用B液（20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L硫基乙醇，5mol/LW,500mL/L異丙醇）流洗30mL,

8、然后用A液（20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L硫基乙醇，5mol/L淼）平衡層析柱至基線，調(diào)整紫外吸收至零點。用8mL/min的流速上樣，上樣結(jié)束后用A液流洗至基線，采用20%B液流洗2個柱體積,收集蛋白峰，記為peakl,再用75%B液洗脫2個柱體積，收集蛋白峰，記為peak2,最后用100%B液洗脫2個柱體積,收集蛋白峰，記為peak3o電泳鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于peak2中。收集peak2,準備陰離子柱純化。畢業(yè)論文1.2.4；強陰離子層析純化QKI7；以8mL/min的流