時間分辨熒光免疫研究法測定甲胎蛋白臨床評價

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1、時間分辨熒光免疫研究法測定甲胎蛋白臨床評價(撫順市中心醫(yī)院，遼寧撫順113006)??摘要：目的：評價時間分辨熒光免疫分析法測定甲胎蛋白的臨床應(yīng)用價值。方法：分別用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法進行AFP測定，進行相關(guān)性分析、精密度試驗和線性分析。結(jié)果：兩法呈正相關(guān)，都有較好的重復(fù)性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯(lián)免疫吸附法，時間分辨熒光免疫分析法比酶聯(lián)免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。結(jié)論：應(yīng)用時間分辨熒光免疫分析法檢測AFP,具有靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，有著良好的發(fā)展前景。?關(guān)鍵詞：甲胎蛋白；時間分辨熒光免疫分析；酶聯(lián)免疫吸附?中圖分類號:R446.6

2、文獻標識碼:A文章編號：1673-2197(2009)03-0104-02?甲胎蛋白(AFP)是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白,分子量約68000,由96%蛋白質(zhì)和4%的碳水化合物組成，成人由肝細胞產(chǎn)生，血清中含量極微。AFP是診斷肝癌最特異的標志物[1],其靈敏度和特異性已經(jīng)達到甚至遠遠超過CT、MRT、同位素掃描、超聲波檢查和血清酶學(xué)檢查，同時檢測孕婦血清中的AFP含量可用于神經(jīng)管缺損畸胎的篩查。這些領(lǐng)域均須對AFP進行定量測定，臨床上檢測AFP的方法有很多，本文采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對65份血清進行AFP測定，報告如下。?1材料與方

3、法?1.1病人與標本?本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清學(xué)AFP檢測陽性，經(jīng)影像學(xué)、組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL,EDTA抗凝。將其中15份血清混合后分裝(用于精密度試驗)，置于-2CTC冰箱中保存,集中測試。?1.2儀器與試劑?TRFIA采用WALLAC公司生產(chǎn)的AutoDELFIA1235型全自動時間分辨熒光分析儀，測定試劑盒為蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，自帶標準物，檢測過程均按照試劑盒說明書進行操作，ELISA采用美國Bioeheek公司產(chǎn)品，定量試劑盒為鄭州博賽生物工程有限責任公司生產(chǎn)。?1.3檢測方法?(1)TRFIAoAFP

4、標準品和樣品25uL/孔?分析緩沖液200UL-*室溫慢速振動60min-＞洗板2次已稀釋(1:50)的Eu3+標記溶液200uL—室溫慢速振動60min^洗板6次一增強液200uL-室溫慢速振動孵育5min-測定熒光值，自動計算AFP值。?(1)ELISAo稀釋液100uL/孔一血清樣本20uL-37°C孵育30min-洗板4次一酶標抗體150?L/孔~37。(2孵育30minf洗板一顯色一酶標儀450nm讀數(shù)測定，自動擬合曲線并計算AFP含量。?1.4統(tǒng)計學(xué)分析?用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，P0.05),直線回歸方程為:Y(TRFIA)=0.938X(ELISA)+0

5、.988,r=0.94,兩法呈正相關(guān)。?2.2精密度試驗?參照NCCLS的精密度評價方案[2],用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法分別對高、中、低3個濃度(參考值分別為800ug/L,170ug/L,5ug/L)的AFP質(zhì)控血清進行重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，兩種方法都有較好的重復(fù)性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯(lián)免疫吸附法，見表lo?2.3線性分析?取髙值混合血清作6點倍比稀釋，各復(fù)測3次，以原倍血清測定值為標準按稀釋倍數(shù)算得其理論值，與兩種方法實際測定值比較進行線性分析，TRFIA回歸方程為：Y二1.04X+7.26,r二0.96；ELISA回歸方程為：Y二0.63X

6、+45.31,r=0.91oTRFIA在0.72?1078ng/L范圍內(nèi)線性良好;ELISA在4.21~535ng/L范圍內(nèi)線性良好。時間分辨熒光免疫分析法比酶聯(lián)免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。?3討論?時間分辨熒光免疫測定的基本原理是以總系元素鎬(Eu)螯合物作為熒光標記物，利用這類熒光物質(zhì)壽命長的特點，延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長壽命總系螯合物的熒光，從而有效排除非特異性本底熒光的干擾而提高靈敏度。TRFIA法的固相技術(shù)，也是保持其靈敏度的一個重要因素，同時增強液在TRFIA中的作用特別重要，優(yōu)質(zhì)的增強液是提高檢測靈敏度的另一個關(guān)鍵因素

7、，加入增強液后，可以使Eu3+從反應(yīng)復(fù)合物中解離下來，游離的Eu3+同增強液中的另一種螯合劑形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在激發(fā)光的激發(fā)下能夠發(fā)出強烈熒光，信號可以增強100萬倍［3］。TRFIA法的批內(nèi)、批間精密度均比ELISA法好，這可能是由于TRFIA法利用了具有獨特熒光特性的總系元素及其螯合物為示蹤物，幾乎完全消除了背景熒光的干擾，且試劑穩(wěn)定性好，因而檢測重現(xiàn)性好；ELISA法檢測影響因素較多，另外，ELISA法定量AFP試劑盒的線性及