人Smad3的shRNA表達載體構建和鑒定.doc

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1、人Smad3的shRNA表達載體構建和鑒定作者：謝橋生雷小英王立鋒孟艷玲王芳薛茜溫偉紅楊安鋼【摘要】目的：構建人Smad3的shRNA表達載體，運用RNAi下調Smad3基因在腫瘤細胞系中的表達，觀察對腫瘤細胞生長的影響?方法：化學合成針對人Smad3基因的dsRNA,瞬時轉染入Hela細胞，檢測RMA干擾效果，篩選冇效干擾靶位點；設計并合成針對人Smeicl3基因的siRNA寡核昔酸鏈，經(jīng)退火形成雙鏈后克隆入質粒載體pSilencerTM3.1Hlhygro,轉染入Hela細胞，JJ]hygromycinB篩選穩(wěn)定單克隆細胞株，對細胞株行RTPCR和WesternBlot檢測

2、，觀察siRNA對靶基因的抑制效果，進一步研究下調FI的分子表達水平以后腫瘤細胞生長的變化.結果：瞬時轉染篩選到了冇效的RNA干擾靶位點，構建載體后，建立穩(wěn)定轉染的單克隆細胞株,Smad3mRNA和蛋白質水平均顯著下調，導致腫瘤細胞生長抑制.結論：成功構建了針對人Smad3高效、特異、作用持久的shRNA表達載體,轉染細胞后可下調Smad3的表達，為進一步研究Smad3的功能和腫瘤的基因治療奠定了基礎.【關鍵詞】Smad3；RNA干擾；遺傳載體；腫瘤生長抑制0引言Smad家族成員是TGFB信號通路中的重要分子，根據(jù)其結構和功能的相似性，可分為三個亞家族，即RSmadsCrece

3、ptorregulatedSmads),CoSmadsCcommonSmads),和ISmads(inhibitorySmads)[1]?Smad3是RSmads中的一個成員，參與細胞增殖、分化、細胞外基質調節(jié)、腫瘤細胞遷移，與其功能相近的還有Smad2,Smadl,Smad5,Smad8.近年來,Smads信號通路在腫瘤細胞屮的作用逐漸引起人們的關注，有望成為腫瘤治療中的潛在有效靶點[2-5]?我們通過瞬時轉染dsRNA（doublestrandedRNA,雙鏈RNA）入Hela細胞，篩選有效的siRNA（smallinterferenceRNA）序列，并構建shRNA（sm

4、allhairpinRNA）表達載體,建立持續(xù)低表達Smad3的穩(wěn)定細胞株，以期進一步探求Smad3下調后對腫瘤牛物學性狀的影響.1材料和方法1.1材料質粒載體pS訂encerTM3.1Hlhygro山西京醫(yī)院劉家云博士惠贈；大腸桿菌DII5a、宮頸癌細胞系Ilela由本實驗室保存；細胞培養(yǎng)試劑、TRIZOLReagentRTPCR試劑盒、hygromycinB,LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（BSA）＞兔抗人antiSmad3多克隆抗體（sc8332,SantaCruz公司）；兔抗人且ntiActin多克隆抗體、HRP標記羊抗

5、兔二抗（武漢博士德公司）；NC膜（Millipore公司）；BCA法蛋白定量試劑盒＞W(wǎng)esternBlot發(fā)光液（Pierce公司）；各種限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；小量質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒屮提試劑盒（Promega公司）?WesternBlot設備（BIORAD公司）；凝膠成像儀（ULTRAVIOLET公司）；高速離心機（Beckman公司）;紫外分光光度計（Ultrospec2000,PharmaciaBiotech公司）；PCR儀（PTC200,MJResearch公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀(Model500,BIORAD公司).1?

6、2方法1.2.1siRNA的設計根據(jù)RNA干擾靶位點的設計原則，從Smad3mRNA(NM_005902)的編碼序列屮尋找符合設計特征的靶位點，經(jīng)BLAST軟件進行同源分析證實為Smad3特異性序列后，選擇其編碼區(qū)第941-959位核昔酸為干擾靶位點，山上海吉瑪公司合成其dsRNA序列，Smad3正義鏈:5'GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT3',反義鏈：5'CGUGUAUUAUUGAACCUGGdTdT3’?由公司提供的陰性對照dsRNA與人類基因無同源性，正義鏈：5’UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3，,反義鏈:5'AAGAGGCUUGCACAGU

7、GCAdTdT3'?1.2.2shRNA表達質粒載體的構建按上述靶位點構建shRNA表達載體，根據(jù)pSilencerTM3.1IIIhygro質粒載體的要求設計1對能編碼shRNA的寡核昔酸鏈，正義鏈：5’GATCCGCACATAATAACTTGGACCTTCAAGAGAGGTCCAAGTTATTATGTGCTTTTTTGGAAA3',反義鏈：5'AGCTTTTCCAAAAAAGCACATAATAACTTGGACCTCTCTTGAAGGTCCAAGTTATTATGTGCG3’；序列兩端包含B