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1、臨床藥理研究所細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)1現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程技術(shù)細(xì)胞工程技術(shù)酶工程技術(shù)發(fā)酵工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)2細(xì)胞分離技術(shù)從血液、體液中分離細(xì)胞從原代組織中分離細(xì)胞從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞--傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)3細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞采血方法：人靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；小動(dòng)物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動(dòng)脈放血。兔耳靜脈或動(dòng)脈穿刺取血。4細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液約用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4μl）；草酸鹽法：取草酸鉀0.2g，草酸銨0.3g，加雙蒸水10ml溶解后，取0.2
2、ml放入5ml的試管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃；枸櫞酸鈉法：先配制2%枸櫞酸鈉，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/LEDTA2μl。5細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞體液標(biāo)本采集：在局部70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關(guān)節(jié)腔等）抽取液體樣品。膝關(guān)節(jié)腔穿刺胸腔穿刺6細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分離：利用細(xì)胞的相對(duì)密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結(jié)合不同速度的離心沉降法將不同的細(xì)胞分離。抗凝血
3、，室溫或37℃下直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細(xì)胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與3%明膠（經(jīng)滅菌消毒）等量或3︰l量混合于離心管中，直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細(xì)胞。7細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單個(gè)核細(xì)胞的分離：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其相對(duì)密度在1.050-1.077之間，采用速度沉降法原理使其分離。淋巴細(xì)胞分離液8細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單核細(xì)胞的分離：利用細(xì)胞在培養(yǎng)過程中貼壁時(shí)間的早晚不同進(jìn)行細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞懸液多將懸液放入12cm直徑的培養(yǎng)皿中
4、，于37℃培養(yǎng)箱中靜置30-60min。此時(shí)單核細(xì)胞貼壁，而淋巴細(xì)胞尚未貼壁，傾出未貼壁細(xì)胞，并用Hanks液輕輕沖洗培養(yǎng)皿以盡量洗下未貼壁細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）。用Hanks液強(qiáng)力沖洗吹打與震蕩，將貼壁的單核細(xì)胞沖落或用刮刀輕刮，收集貼壁的單核細(xì)胞。計(jì)數(shù)后分別制備所需濃度的細(xì)胞懸液。9細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞黏附法分離血中單核細(xì)胞、T，B淋巴細(xì)胞因B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與T淋巴細(xì)胞分離。10具體步驟：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的細(xì)胞懸液。先用Hanks液，再用含20%小
5、牛血清的RPMI-1640液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。將尼龍柱預(yù)溫37℃，再用配制的單個(gè)核細(xì)胞懸液2ml裝入尼龍纖維柱，不使流出，37℃溫箱內(nèi)靜置l小時(shí)。取下注射針頭，用預(yù)溫37℃含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的T淋巴細(xì)胞。從注射器內(nèi)取出尼龍纖維，在4℃的RPMI-1640液內(nèi)漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的B細(xì)胞洗脫收集（B淋巴細(xì)胞中混有的單核細(xì)胞可用貼壁法將其分離）。收集的T、B淋巴細(xì)胞可分別用Hanks液懸浮，洗滌，離心（250g，7min），并重復(fù)洗滌3次。計(jì)算活細(xì)胞，計(jì)數(shù)懸液中的細(xì)胞數(shù)后制備所需濃度的T和B淋巴細(xì)胞懸液
6、。11細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠法(MACS)分離T、B淋巴細(xì)胞：磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場(chǎng)的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對(duì)某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。12細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁性微珠用于細(xì)胞的分離和純化的基本原理及步驟是：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)
7、分離，達(dá)到純化、分離的目的。通常有二種分離方式：陽性分離和陰性分離。陽性分離是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞，陰性分離是利用磁珠去除無關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以分離。13細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠分離細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于人類各種細(xì)胞的分離，如T(CD3)、B(CD19)淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)、造血祖細(xì)胞(CD34)、單核/巨噬細(xì)胞(CD14)、胰島細(xì)胞(胰島GK和GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子）)、多種腫瘤細(xì)胞等。14細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞15細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中
