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1、臨床藥理研究所細胞分離與培養(yǎng)技術1現(xiàn)代生物技術基因工程技術細胞工程技術酶工程技術發(fā)酵工程技術細胞培養(yǎng)2細胞分離技術從血液、體液中分離細胞從原代組織中分離細胞從原培養(yǎng)容器中分離細胞--傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)3細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞采血方法：人靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；小動物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動脈放血。兔耳靜脈或動脈穿刺取血。4細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液約用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4μl）；草酸鹽法：取草酸鉀0.2g，草酸銨0.3g，加雙蒸水10ml溶解后，取0.2
2、ml放入5ml的試管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃；枸櫞酸鈉法：先配制2%枸櫞酸鈉，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/LEDTA2μl。5細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞體液標本采集：在局部70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關節(jié)腔等）抽取液體樣品。膝關節(jié)腔穿刺胸腔穿刺6細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞血樣中紅細胞和白細胞的分離：利用細胞的相對密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結合不同速度的離心沉降法將不同的細胞分離?？鼓?/p>
3、，室溫或37℃下直立靜置30-60min，紅細胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與3%明膠（經(jīng)滅菌消毒）等量或3︰l量混合于離心管中，直立靜置30-60min，紅細胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細胞。7細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞血中單個核細胞的分離：單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其相對密度在1.050-1.077之間，采用速度沉降法原理使其分離。淋巴細胞分離液8細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞血中單核細胞的分離：利用細胞在培養(yǎng)過程中貼壁時間的早晚不同進行細胞分離單個核細胞懸液多將懸液放入12cm直徑的培養(yǎng)皿中
4、，于37℃培養(yǎng)箱中靜置30-60min。此時單核細胞貼壁，而淋巴細胞尚未貼壁，傾出未貼壁細胞，并用Hanks液輕輕沖洗培養(yǎng)皿以盡量洗下未貼壁細胞（淋巴細胞）。用Hanks液強力沖洗吹打與震蕩，將貼壁的單核細胞沖落或用刮刀輕刮，收集貼壁的單核細胞。計數(shù)后分別制備所需濃度的細胞懸液。9細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞黏附法分離血中單核細胞、T，B淋巴細胞因B淋巴細胞和單核細胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與T淋巴細胞分離。10具體步驟：單個核細胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的細胞懸液。先用Hanks液，再用含20%小
5、牛血清的RPMI-1640液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。將尼龍柱預溫37℃，再用配制的單個核細胞懸液2ml裝入尼龍纖維柱，不使流出，37℃溫箱內(nèi)靜置l小時。取下注射針頭，用預溫37℃含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的T淋巴細胞。從注射器內(nèi)取出尼龍纖維，在4℃的RPMI-1640液內(nèi)漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的B細胞洗脫收集（B淋巴細胞中混有的單核細胞可用貼壁法將其分離）。收集的T、B淋巴細胞可分別用Hanks液懸浮，洗滌，離心（250g，7min），并重復洗滌3次。計算活細胞，計數(shù)懸液中的細胞數(shù)后制備所需濃度的T和B淋巴細胞懸液
6、。11細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞免疫磁珠法(MACS)分離T、B淋巴細胞：磁性微珠是20世紀80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對某種細胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。12細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞免疫磁性微珠用于細胞的分離和純化的基本原理及步驟是：首先將抗特異細胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細胞反應后，利用磁力的作用，使與致敏結合的細胞與其它物質(zhì)
7、分離，達到純化、分離的目的。通常有二種分離方式：陽性分離和陰性分離。陽性分離是直接從細胞混合液中分離出靶細胞，陰性分離是利用磁珠去除無關細胞，使靶細胞得以分離。13細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞免疫磁珠分離細胞已被廣泛應用于人類各種細胞的分離，如T(CD3)、B(CD19)淋巴細胞、內(nèi)皮細胞(CD34)、造血祖細胞(CD34)、單核/巨噬細胞(CD14)、胰島細胞(胰島GK和GLUT2（葡萄糖轉運子）)、多種腫瘤細胞等。14細胞分離技術--從血液、體液中分離細胞15細胞分離技術--從血液、體液中
