HPLC培訓(xùn)(峰與色譜條件).ppt

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1、HPLC高效液相色譜基本原理加樣流動(dòng)相流動(dòng)相ACBBCA固定相——柱內(nèi)填料，流動(dòng)相——洗脫劑。HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程?；静僮?.打開泵電源，待自檢完成后打開“Purge”閥進(jìn)行排液以除去泵頭之前的氣泡，排氣完成后關(guān)閉“Purge”閥。按“Pump”鍵開啟泵，然后按“func”及數(shù)字鍵以0.2ml/min的速度慢慢將流速調(diào)1.0ml/min（其中測(cè)甘油果糖氯化鈉注射液時(shí)應(yīng)以0.1ml/min的速度慢慢將流速調(diào)0.5ml/min）。2.一般柱平衡時(shí)間為30min左右

2、（測(cè)甘油果糖氯化鈉注射液時(shí)平衡時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)些），此時(shí)依次打開檢測(cè)器、工作站電源，打開計(jì)算機(jī)中工作站，待儀器自檢連接完成后查看基線，如基線平穩(wěn)即可進(jìn)樣采集數(shù)據(jù)。3.檢測(cè)完成后，關(guān)閉計(jì)算機(jī)中工作站、檢測(cè)器、工作站電源，將泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”鍵關(guān)閉泵，將流動(dòng)相換至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速?zèng)_洗色譜柱30-60min。4.最后將色譜柱充滿純甲醇保存。5.手動(dòng)進(jìn)樣器使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣閥，除去殘留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防止灰塵顆粒。流動(dòng)相的配制①配制用水最好用蒸餾水（注射水）②稱量、量取、調(diào)

3、pH時(shí)盡可能精確③流動(dòng)相必須用0.45um濾膜過濾，注意區(qū)分有機(jī)膜、無機(jī)膜④加入甲醇或乙腈后要混合充分⑤流動(dòng)相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣）⑥配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替⑦流動(dòng)相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動(dòng)相禁止使用⑧配制過程中應(yīng)注意自我保護(hù)流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離

4、性能。常用的脫氣方法比較：氦氣脫氣法加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。色譜柱的良好使用規(guī)范溶劑使用前必須過濾運(yùn)輸中變干了的色譜柱要完全浸濕（預(yù)處理）如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的組分時(shí),必須進(jìn)行前處理清楚了解色譜柱填料適用的pH范圍(3-7)，溫度(<60),化學(xué)適應(yīng)性使用新鮮的水溶液,流動(dòng)相現(xiàn)用現(xiàn)配制

5、定期用強(qiáng)極性溶劑沖洗色譜柱儲(chǔ)存色譜柱時(shí),要將緩沖液沖洗干凈,并保存在適合的溶劑中,如甲醇、乙腈避免操作不當(dāng)損壞色譜柱,如:猛敲,跌落或過緊擰接頭最常用的“萬(wàn)能柱”填料為“C18”，簡(jiǎn)稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS)是長(zhǎng)鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛。按鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：⑴反相柱：填料為非

6、極性，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。⑵正相柱：填料為極性，官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相：陽(yáng)離子官能團(tuán)：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。陰離子官能團(tuán)：―R4N＋季銨基、-氨基等。（由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）色譜柱的故障診斷--基線噪音可能的原因:1、流動(dòng)相脫氣不徹底2、檢測(cè)器流通池污染或有氣泡3、檢測(cè)器光源能量不穩(wěn)4、周期性噪音可能由泵的脈動(dòng)引起5、電子放大電路不穩(wěn)定Time(min.)色譜

7、柱故障診斷--基線漂移可能的原因梯度洗脫流動(dòng)相不干凈溫度波動(dòng)(對(duì)示差折光檢測(cè)器影響更大)流動(dòng)相與色譜柱未達(dá)到平衡系統(tǒng)中污染物流失電子線路不穩(wěn)定檢測(cè)器預(yù)熱時(shí)間不夠進(jìn)樣器中殘留，硬件與流動(dòng)相不相容，如Peek材料與不合適的有機(jī)溶劑合用色譜柱故障診斷--鬼峰鬼峰-—是指在未進(jìn)樣時(shí)也能出現(xiàn)的色譜峰原因：1、流動(dòng)相不干凈，尤其是弱極性流動(dòng)相，RPC中水的純度比甲醇影響更大；2、樣品的交叉污染20%-100%MeOH6015301507色譜柱故障診斷--峰形問題可能的原因：1、色譜柱柱床塌陷，出現(xiàn)死體積2、過濾片部分堵塞3、兩個(gè)組分共同流出，形成一個(gè)峰(DA

8、D)4、樣品溶劑不匹配色譜柱柱床塌陷，出現(xiàn)死體積色譜柱故障診斷--峰形問題所有的峰都變寬1.柱效降低，柱床塌陷2.進(jìn)樣體積（質(zhì)量）過大3