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《豬瘟病毒熒光定量RT-PCR和RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(3)：1—5ProgressinVeterinaryMedicine豬瘟病毒熒光定量RT—PCR和RT—LAMP快速檢測(cè)方法的建立唐景峰，周康平，韓振偉，王業(yè)富(武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430072)摘要：建立了應(yīng)用TaqMan—LNA的熒光定量RT—PCR和反轉(zhuǎn)錄一環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT—LAMP)技術(shù)檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)的兩種方法。根據(jù)對(duì)NCBI中CSFVE2基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了CSFVE2基因的引物和探針，并以E2基因?yàn)槟０鍢?gòu)建了重組質(zhì)粒。通過(guò)梯度稀釋陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)表明熒光定量RT—PCR和R
2、T—LAMP檢測(cè)下限分別為10拷貝／uL和10拷貝／gL；特異性試驗(yàn)表明，兩種方法對(duì)于其他5種病毒不能檢出，具有良好的特異性。臨床樣本檢測(cè)同樣表明兩種方法都具有良好的特異性和靈敏度。說(shuō)明所建立的TaqMan—LNA熒光定量RT—PCR和RT—LAMP可應(yīng)用于CSFV的檢測(cè)。關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；熒光定量RT—PCR；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中圖分類號(hào)：$852．651文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007—5038(2014)03—0001—05豬瘟(Classicalswinefever，CSF)為世界動(dòng)物dong／1105／2009株H1N1AIV、CH一
3、1a株P(guān)RRSV、衛(wèi)生組織(OfficeInternationalDesEpizooties，OIE)石門株CSFV由武漢大學(xué)王業(yè)富實(shí)驗(yàn)室保存。規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，也是我國(guó)規(guī)定的一1．1．2主要試劑與主要儀器Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄類動(dòng)物傳染病，世界范圍內(nèi)大約有50個(gè)國(guó)家及地區(qū)酶，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司公司；Taq酶、暴發(fā)或報(bào)道過(guò)豬瘟，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展口]。dNTP購(gòu)自武漢三益公司；BstDNA聚合酶，購(gòu)自E2為CSFV4種結(jié)構(gòu)蛋白(即C、E、E1及Gene公司；ABI7500熒光定量PCR儀，購(gòu)自LifeE2)之一，為
4、囊膜上的主要結(jié)構(gòu)糖蛋白，是病毒主要TechnoLogies公司。保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。研究表明1．2方法E2分子含A、B、c、D4個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，A區(qū)又分為31．2．1引物和探針的設(shè)計(jì)和合成在NCBI上獲個(gè)亞區(qū)，其中，A1、B、C在功能上具有中和性，其他取在中國(guó)流行的CSFVE2序列，經(jīng)由Mega4．0進(jìn)結(jié)構(gòu)域則無(wú)此作用；編碼E2蛋白的基因具高突變行比對(duì)，利用BeaconDesigner7．0設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)率，對(duì)于該基因的研究具有重要的意義_2]。CSFVE2熒光定量PCR特異性引物和探針，其中熒光定量PCR(real—timePC
5、R)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增CSFVE2基因代表序列為FJ598612(Shimen—ZJ(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)均株)，利用PrimerExpLoerV4設(shè)計(jì)CSFVE2是近年來(lái)常用的一種檢測(cè)病毒的方法，其中LAMP法LAMP特異性引物(表1)，主要針對(duì)經(jīng)典石門株等自2000年發(fā)明來(lái)，由于其快速和極高的靈敏度，使其在進(jìn)行檢測(cè)，其中E2基因代表序列為HQ380241(CS—檢測(cè)方面得到快速的發(fā)展及應(yīng)用_4。]。本試驗(yàn)針對(duì)CS—FV—PY一2009)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)FV建立
6、了熒光定量RT-PCR和RT-LAMP兩種檢測(cè)有限公司合成，探針委托江蘇碩世生物科技有限公方法，并證明了兩種方法都具有良好的特異性和靈敏司合成。度，能有效的應(yīng)用于豬瘟病毒的檢測(cè)。1．2．2豬瘟病毒RNA提取參照Trizol試劑操1材料與方法作說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA，并于一80℃凍存?zhèn)溆谩?．1材料1．2．3標(biāo)準(zhǔn)品的制備以CSFVRNA為模板，以1．1．1病毒株O／NY00株O—FMDV、A／Guang—Random6primer為引物逆轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA。收稿日期：2013—09—14基金項(xiàng)目：質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201110036—03
7、)作者簡(jiǎn)介：唐景峰(1982一)，男，湖北人，博士研究生，主要從事臨床診斷和病毒機(jī)理研究。*通訊作者2動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2Ol4年第35卷第3期(總第249期)再以CSFV的cDNA為模板，以real—time—F／real1．2．4熒光定量RT—PCR和RTIAMP反應(yīng)體系time—R及LAMP—F3／IAMP—B3為引物進(jìn)行PCR及優(yōu)化用以上制備的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)Taq-Man擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94C5rain；94。C30S，58℃15模式的熒光定量RT—PCR反應(yīng)條件根據(jù)武漢三益S，72℃30S，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR一擴(kuò)增一
8、一的Taq酶～說(shuō)呈～明：書(shū)進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳引物和探針_工m晏=產(chǎn)物用20g／i的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將切膠純的濃度、反應(yīng)溫度及條件。用以上cRNA
