時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)

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1、時(shí)間分辨熒光技術(shù)廣州市源起生物科技有限公司培　　　訓(xùn)主要內(nèi)容時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。TRF的標(biāo)記物及特點(diǎn)。為什么叫“時(shí)間分辨”?TRF在免疫分析方法學(xué)中的地位。各種免疫方法學(xué)的比較。臨床應(yīng)用回顧標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展放射免疫（精度：10-12mol/L）酶聯(lián)免疫（精度：10-9mol/L）膠體金標(biāo)記（金標(biāo)：10-15mol/L）化學(xué)發(fā)光（精度：10-15mol/L）電化學(xué)發(fā)光（精度：10-17mol/L）時(shí)間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片時(shí)間分辨熒光技術(shù)（Time-ResolvedFluorescence）時(shí)間分辨熒光免疫

2、分析（TRFIA）時(shí)間分辨免疫熒光分析（TRIFMA）時(shí)間分辨熒光核酸探針分析時(shí)間分辨熒光細(xì)胞活性分析時(shí)間分辨熒光探針分析時(shí)間分辨熒光技術(shù)原理（TRF）用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)；當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點(diǎn)（特異性強(qiáng)、熒光光譜的Stokes位移、壽命長(zhǎng)），用時(shí)間分辨熒光分析儀，測(cè)定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。時(shí)間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolv

3、edFluorescenceImmunoassay）時(shí)間分辨熒光免疫試劑工作原理示意圖微量反應(yīng)孔包被好的表面抗體表面抗原V標(biāo)記物輕鏈螯合劑Eu重鏈VV標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、锝(Te)鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：熒光壽命極長(zhǎng)鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1~100us樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10us，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm）銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的St

4、okes位移為28nm熒光特異性強(qiáng)。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時(shí)間段檢測(cè)特異性熒光而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0時(shí)間分辨熒光免疫原理圖利用鑭系元素光譜特點(diǎn)，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。DELFIA技術(shù)為臨床檢測(cè)帶來的先進(jìn)性技術(shù)特點(diǎn)檢驗(yàn)先進(jìn)性時(shí)間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、高特異性解離-增強(qiáng)

5、熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復(fù)性更好原子標(biāo)記標(biāo)記位點(diǎn)多，可達(dá)20個(gè)對(duì)標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標(biāo)準(zhǔn)曲線保留時(shí)間長(zhǎng)同一批次只需兩點(diǎn)定標(biāo)多標(biāo)記單，雙，三，四標(biāo)記同一試劑盒可同時(shí)測(cè)多個(gè)項(xiàng)目靈敏度更高，檢測(cè)范圍更廣以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書試劑DELFIAImmuliteACS-180AFP0.1-1000IU/ml0.2-300IU/ml1.0-1000IU/mlCEA0.1-500ng/ml0.2-500ng/ml0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/

6、L5-5000U/L2-1000U/LTSH0.005-100μU/ml0.002-75μU/ml0.03-150μU/mlFSH0.05-256mU/ml0.1-170mU/ml0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L無0.1-40ng/mlProlactin0.04-250ng/ml0.5-150ng/ml0.3-200ng/ml時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點(diǎn)法加批次的參考曲線定標(biāo)0.5125102050100200500U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6標(biāo)

7、準(zhǔn)曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期時(shí)間長(zhǎng)放射性免疫分析法（RIA）應(yīng)用放免自60年代問世以來對(duì)臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項(xiàng)較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法的標(biāo)記原理為以后的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點(diǎn)放射性（125I），對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，該方法已經(jīng)為重視環(huán)保的國(guó)家逐步取消。（如整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。操作繁瑣，出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)。無法保存?zhèn)溆谩Ｃ该庖叻治龇ǎ‥LISA）應(yīng)用酶免的最大優(yōu)勢(shì)在于避免了對(duì)

8、環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長(zhǎng)。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測(cè)手段。缺點(diǎn)靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因