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《甲基化引物探針設(shè)計(jì)方法.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、.本文敘述了一種用于甲基化分析的探針法定量PCR的引物和探針設(shè)計(jì)方法，目前用于甲基化檢測的引物探針設(shè)計(jì)工具非常多，都有使用成功的案例，經(jīng)過初步多方嘗試，本文中敘述的為本人認(rèn)為較為靠譜的方法。Oligo7的優(yōu)勢在于專業(yè)，參數(shù)詳盡且可自由設(shè)置，模塊化設(shè)計(jì)，學(xué)會后使用便利。專業(yè)的活就是要專業(yè)的用專業(yè)的工具干。..頁腳..首先是進(jìn)行序列轉(zhuǎn)換，有較多的在線工具和聯(lián)機(jī)軟件都可實(shí)現(xiàn)，這里使用.urogene.org/methprimer/，較為簡單直觀。..頁腳..直接將目標(biāo)序列放入如上圖的編輯框中，此也可直接用于相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，不過
2、本人沒使用過，因?yàn)椴荒茉O(shè)計(jì)探針。submit后就有轉(zhuǎn)化后的序列信息，如下圖：以上詳細(xì)標(biāo)記了CpG位置和非CpG位置的C，可直接復(fù)制到Word標(biāo)注使用，下面就可以使用Oligo7利用上邊的序列設(shè)計(jì)引物和探針了，如果是設(shè)計(jì)非甲基化引物探針，則使用原始序列。..頁腳..關(guān)于引物和探針的一些主要參數(shù)，主要參考invtrogen的建議：Primer設(shè)計(jì)的基本原則：a)引物長度一般在18-35mer。b)G-C含量控制在40-60%左右。c)避免近3’端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。d)如果可能避免在3’端最后5個堿基有2個以上的G或C。e
3、)如果可能避免在3’端最后1個堿基為A。f)避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。g)退火溫度Tm控制在58-60C左右。h)如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。TaqMan探針設(shè)計(jì)的基本原則：a)TaqMan探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。b)長度一般為18-40mer。c)G-C含量控制在40-80%左右。d)避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。e)在引物的5’端避免使用G。f)選用比較多的堿基C。g)退火溫度Tm控制在
4、68-70℃左右。另：目標(biāo)變異堿基最好在3’末端或3’末端-1位置，保證擴(kuò)增特異性，對于甲基化，則最好是C。..頁腳..打開軟件，有以上幾種方式可以建立新的序列文件，建立好的文件可保存，下次繼續(xù)處理，此處直接復(fù)制轉(zhuǎn)化后的序列。..頁腳..建立好的用來設(shè)計(jì)引物和探針的序列。如果選擇自動搜索，選擇如下菜單，選擇后彈出相應(yīng)的設(shè)置項(xiàng)。..頁腳..SearchforPrimer&Probes的主要設(shè)置項(xiàng)目在Parameters和Ranges兩個子項(xiàng)中。..頁腳..以上根據(jù)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系調(diào)整，這里主要是反應(yīng)體系中各離子濃度。
5、對于甲基化PCR影響較大的應(yīng)該是鎂離子濃度，如果需要可以重點(diǎn)優(yōu)化一下。..頁腳..Constraints是各約束條件設(shè)置，每個設(shè)置項(xiàng)在幫助文件中有詳細(xì)解釋，我在這里只設(shè)置PrimerLength和Tm值相關(guān)的選項(xiàng)，前邊的鎖形標(biāo)記表示強(qiáng)制要求和建議要求。對于甲基化PCR，有一種理論認(rèn)為增加引物長度（30mer左右）減小產(chǎn)物長度（小于150mer）能增加PCR反應(yīng)的敏感性，即更容易得到擴(kuò)增，經(jīng)過嘗試，有一定效果。..頁腳..SearchRanges選項(xiàng)，做一些序列位置和產(chǎn)物長度的限定。除以上提到的設(shè)置條件，其他條件可根據(jù)項(xiàng)目
6、含義調(diào)整，如果不了解則使用默認(rèn)設(shè)置即可。以上條件都設(shè)置后，可能會出現(xiàn)SearchFiled的情況，是因?yàn)樵O(shè)置的條件無法滿足，此時需要修改為更寬松的條件，另外如果序列太長Search時間可能會較長。..頁腳..Seacrh完成后，如下圖，這里同時調(diào)出CurrentOligo和SelectedOligos的KeyInfo，如下圖：..頁腳..這里最重要的信息是Score，基本上大于700points的，據(jù)我測試都能成功，可見此處的算法比較合理。本人還做個一個實(shí)驗(yàn)，用不同軟件對同一段序列設(shè)計(jì)引物探針，相互評估，就算完全一樣的序
7、列各自計(jì)算出的不管是Tm值還是其他分?jǐn)?shù)都差距不小，所以只能選擇一個軟件設(shè)計(jì)的合成后測試了，Oligo7是目前設(shè)計(jì)使用成功率較高的一個，差別的原因是各家算法不同，部分軟件會給出詳細(xì)的計(jì)算公式，如果感興趣可以查看了解。..頁腳..雖然指定了大致設(shè)計(jì)位置，但以上設(shè)計(jì)的引物探針位置不一定是我們需要的位置，特別是我們需要指定某幾個CpG被包含的情況，這就需要用到軟件的評估功能了。打開Edit菜單下的對話框，其中用UpperOligo或LowerOligo表示Probe，分別為正鏈和反鏈互補(bǔ)序列。..頁腳..打開編輯框后，根據(jù)自身需
8、求調(diào)整引物和探針的長度及位置，輸入下圖中的編輯框后確認(rèn)，這里主要需要關(guān)注如下圖紅色框中的信息，原則有幾點(diǎn)：a)EditFowardPrimer輸入正向序列，EditFowardPrimer輸入反向互補(bǔ)序列，EditUpper/LowerPrimer輸入正向/反向互補(bǔ)序列，每項(xiàng)編輯后點(diǎn)擊確認(rèn)小勾，相應(yīng)的參數(shù)會列出，這里
