引物探針設計培訓資料.ppt

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1、Taqman法熒光PCR引物探針設計與目標序列互補實時熒光定量PCRTaqMan法TaqMan---水解型雜交探針5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqMan法PCR反應的建立1、引物、探針的設計：探針Tm為68-70℃，20－30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素

2、，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為58-60℃2、反應參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同總體原則查閱參考文獻，以選取待檢病原體的靶基因。目的基因序列大量查找，利用DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA比對，確定種內高保守，種間高特異的區(qū)域為設計引物探針的靶序列先選擇好探針，然后設計

3、引物使其盡可能的靠近探針。所選序列應該高度特異，盡量選擇具有最小二級結構的擴增片段——這是因為二級結構會影響反應效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進行二級結構檢測，如果不能避免二級結構，那么就要相應提高退火溫度。擴增長度應不超過400bp，理想的最好能在100-150bp內，擴增片段越短，有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性。保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號。為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）

4、將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結構的形成。探針設計原則探針位置盡可能地靠近上游引物探針長度應在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結合特異性檢測探針的DNA折疊和二級結構Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探針的5’端應避免使用G鳥嘌呤——因為5‘G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，如

5、果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。引物設計原則序列選取應在基因的保守區(qū)段避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之間的TM相差避免超過2℃引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)

6、3個或3個以上連續(xù)相同的堿基為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。Taqman探針技術要求片段長度在50bp－150bp引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。TaqMan法優(yōu)缺點對目標序列的高特異性-----陰性結果確定設計相對簡單------與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點TMA檢測技術示意圖TMA擴增反應原理圖技術原理同一溫度下，首先通過M-MLV反轉錄酶產(chǎn)生靶標核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～

7、1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環(huán)情況。分子信標探針結構自由能控制在3~5之間Non-T7引物CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTTT7引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAacctatcctatttgtacatccattcaTMA檢測技術的優(yōu)勢→領先的RNA檢測技術TMA技術檢測病原體RNA。一個病原體細胞內含有多達個RNA拷貝，大大提高了檢測靈敏度?！冗M的恒溫擴增技術核酸擴

8、增在一個溫度下進行（42℃），不需要熱循環(huán)。→更高的檢測靈敏度和準確性TMA技術的擴增效率極高