引物探針設(shè)計(jì)簡介

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1、引物探針設(shè)計(jì)簡介已有2993次閱讀2009-1-120:48

2、個(gè)人分類:課堂集錦

3、系統(tǒng)分類:科研筆記1．寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識(shí)別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反

4、應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計(jì)算機(jī)軟件中被編碼和限定。計(jì)算機(jī)的高速度可完成對(duì)引物位置、長度以及適應(yīng)用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計(jì)算。通過對(duì)成千種組合的檢測(cè)，調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，可提出適合用戶特殊實(shí)驗(yàn)的引物。因此通過計(jì)算機(jī)軟件選擇的引物的總體“質(zhì)量”（由用戶在程序參數(shù)中設(shè)定）保證優(yōu)于通過人工導(dǎo)出的引物。需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因

5、此可包含啟動(dòng)子序列、限制酶識(shí)別位點(diǎn)或5'端的各種修飾，這種對(duì)引物的修飾不會(huì)妨礙PCR反應(yīng)，而會(huì)在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。2．基本PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù)引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長量的接近程度。①引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度

6、）幾度的范圍內(nèi)，18到24個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個(gè)核苷酸。引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。②引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3

7、'末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5'端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3'端或近3'端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3'末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。

8、一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差，因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的引物時(shí)，這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說，一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。(條帶淺的調(diào)整:1.明確所擴(kuò)基因的特性:用來研究什么.預(yù)期的表達(dá)怎么樣.文獻(xiàn)中如何報(bào)道.說不定它

9、就是一個(gè)低表達(dá)乃至表達(dá)降低的基因.2.模板量如何確定很重要:模板的上樣量是否很低?有沒有做內(nèi)參如ACTB或者TUBLIN做下對(duì)照看看他們表達(dá)怎么樣.是不是也是很低,若太低或擴(kuò)不出來說明你的體系有問題.上樣量也許可以調(diào)整一下.3.Tm的調(diào)整:設(shè)計(jì)引物的時(shí)候軟件會(huì)給出一個(gè)TM;公司合成回來的單子上還會(huì)有個(gè)TM.一般這兩個(gè)TM是不一樣的.我們一般都先按公司給的溫度來擴(kuò).調(diào)整TM的最大目的不是看產(chǎn)物量如何,而是看產(chǎn)物特異性.如果TM值過低了,就可能有非特異條帶出現(xiàn),這個(gè)時(shí)候要適當(dāng)提高TM值來除掉非特異闊增雜帶.這個(gè)是調(diào)整TM值的

10、主要目的我覺得.4.用內(nèi)參調(diào)整好模板量后,先做一個(gè)溫度梯度PCR:如50-56度先做7個(gè)樣來最終確定你的最適宜TM值.之后建議再按這個(gè)TM溫度,做一個(gè)循環(huán)梯度PCR,做曲線后選擇最適宜的循環(huán)數(shù)(有經(jīng)驗(yàn)的話也可以根據(jù)各條帶亮度肉眼大概確認(rèn)最佳循環(huán)數(shù)).5.小細(xì)節(jié)方面的問題:比如可以新鋪一板膠來檢樣而不用舊膠.防止由于E