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1、2.基因組DNA的分離與純化第六章核酸的分離與純化1.核酸分離純化的原則4.RNA的分離與純化主要內(nèi)容3.質(zhì)粒DNA的提取與純化?核酸的分類、分布及意義概述?核酸分離純化的意義?核酸的存在方式：DNP、RNP?核酸的結(jié)構(gòu)特征PaperTowels核酸分離的技術(shù)路線1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpin第一節(jié)核酸分離與純化的原則?材料與方法的選擇原則?技術(shù)路線的設(shè)計(jì)?核酸的鑒定與保存實(shí)驗(yàn)要求：1.質(zhì)量高:完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求；2.方法好：簡便快速、安全、經(jīng)濟(jì)；3.標(biāo)本易得:血液、尿液、組織切
2、塊、培養(yǎng)的細(xì)胞和細(xì)菌等。一、材料與方法的選擇核酸完整性的保持：1.避免過酸和過堿環(huán)境，pH在4-10之間；2.避免高溫破壞，0-4?C進(jìn)行；3.簡化步驟，縮短時(shí)間，減少破壞；4.抑制DNA酶和RNA酶的活性:用EDTA、檸檬酸鹽絡(luò)合Mg2+、Ca2+等離子。二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)核酸的釋放：1.細(xì)胞破碎方法中機(jī)械剪切法不能用于基因組DNA的提??；2.非機(jī)械法常用化學(xué)試劑或酶細(xì)胞溶解法。核酸的分離與純化：1.除去蛋白質(zhì)、多糖、脂類等大分子物質(zhì)；2.除去非目的核酸組分：3.除去實(shí)驗(yàn)溶液和試劑：核酸的濃縮、沉淀與洗滌：1.濃縮：提高樣品濃度；2.沉淀：
3、常用的濃縮方法，如醋酸鈉、醋酸銨等3.洗滌：除去共沉淀的鹽，常用70%-75%的乙醇。三、核酸的鑒定與保存濃度鑒定：1.紫外分光光度法：原理：紫外吸收特性粗略定量：1OD相當(dāng)于50?g/ml雙鏈DNA，38?g/ml單鏈DNA或單鏈RNA，33?g/ml單鏈寡聚核苷酸；準(zhǔn)確定量：摩爾消光系數(shù)法計(jì)算鹽溶液的影響：測定A310校正適用濃度：大于0.25?g/ml2.熒光光度法：原理：熒光染料溴化乙錠（ethidiumbromideEB）嵌入堿基平面，在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生橙紅色熒光粗略定量：與分子量標(biāo)準(zhǔn)物對比；準(zhǔn)確定量：熒光分光光度計(jì)，靈敏度達(dá)1-
4、5ng/ml其它熒光染料：SYBRgold，靈敏度達(dá)20pg/ml；SYBRGreenI等適用濃度：大于0.25?g/ml純度鑒定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白質(zhì)和核酸紫外吸收特性的差異純度鑒定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白質(zhì)和核酸紫外吸收特性的差異純DNA：A260/A280=1.8，純RNA：A260/A280=2.0；比值降低：蛋白質(zhì)污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA變性、RNA污染混合污染：比值正常緩沖液的影響：在TE緩沖液和水、Tris等緩沖液中的比值有變化，應(yīng)注意校正。核酸的紫外吸收特性2202402602803
5、00消光系數(shù)A260A280=1.6-1.8AGCTU核酸的最大吸收峰在?=260nm蛋白質(zhì)的最大吸收峰在?=280nm酚的最大吸收峰在?=270nm純度鑒定1.紫外法：蛋白質(zhì)和核酸紫外吸收特性的差異2.熒光光度法：原理：凝膠電泳觀察圖譜RNA電泳圖譜：原核生物5S、16S、23S三條帶；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三條帶；DNA分子大，遷移率小完整性鑒定：1.凝膠電泳法：根據(jù)電泳條帶的數(shù)目、位置和形狀判定RNA分子可以通過熒光強(qiáng)度積分來判定有無降解。2.其它方法：逆轉(zhuǎn)錄法、核酸雜交、芯片檢測等。SampleWell25ng1kb
6、ladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisSybergoldDetectionLimit:~0.2-0.5ngDNAEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNAResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRI核酸的保存：1.DNA的保存：-70?C，TE緩沖液中數(shù)年，加入氯仿可防止污染原理：2.RNA的保存：-70?C，醋酸鈉溶液或焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液中，較長期保存。第二節(jié)基因組DNA
7、的分離與純化基因組DNA的特點(diǎn)：1.分子大，容易斷裂2.容易污染其它來源的DNA分離純化方法：1.酚抽提法2.甲酰胺解聚法3.玻棒纏繞法4.異丙醇沉淀法基因組DNA分離純化技術(shù)路線生物體組織細(xì)胞裂解酚抽提法玻棒纏繞法甲酰胺解聚法DNA粗制品電泳分離特定DNA片段鹽析法沉淀有機(jī)溶劑抽提法乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品凝膠中特定DNA片段酚抽提法tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinDNA樣品的純化：1.分子大，容易斷裂2.容易污染其它來源的DNA純化方法：1.透析2.層析3.選擇性沉淀4.凝膠電泳Agarose
8、GelElectrophoresis_+3片段回收回收方法：1.DEAE纖維素膜插片電泳2.轉(zhuǎn)膜電泳法、透析袋電泳法3.凝膠洗脫法4.冷凍擠壓法5.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠
