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1、設計跨內含子引物的方法一、為什么要設計跨內含子的引物區(qū)別或消除gDNA的擴增二、如何設計1、在pubmed上找到目標基因的DNA序列以及其內含子和外顯子情況步驟：打開NCBI主頁面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，links到geneback即可顯示出該基因DNA的信息,這是基因組DNA,從mRNA選項中JION后面的是外顯子的位置，為了以后的操作，可以把這個DNA序列、外顯子和CDS序列的起至位置記下來。2、在pubmed上找到目標基因的mRNA序列步驟：打開NCBI主頁面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，點擊進入基因頁
2、面，即可顯示出這個基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它記下來。注：最好能找到以NM或XM開頭的序列，以此做為設計引物的模板。NCBIRefSeq(美國國立生物技術信息中心參考序列庫)是目前世界上最完整和最具有權威性的人類基因組編碼mRNA序列數(shù)據(jù)庫。它已收集了大約17,500個經(jīng)cDNA測序證實的"NM"序列，還有大約10,000個主要由計算機推測產(chǎn)生的"XM"序列。由于一些序列來自異常連接產(chǎn)生的轉錄物或由計算機推演產(chǎn)生的不正確內含子-外顯子剪切，因此該數(shù)據(jù)庫所收集的參考序列一直在不斷地被修改中，盡管如此，NCBIRefSeq仍
3、是目前最可信賴的人類基因mRNA序列數(shù)據(jù)庫。3、如何設計跨內含子的引物（利用primer5）步驟：1）、在第2步頁面右邊，點擊realtimePCR一般產(chǎn)物長度為80～150bp，引物長度15~20bp，點擊GETprimer。2）、會得到若干條引物，從圖中信息即可看出跨內含子的引物，建議只用BLST找到跨內含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer5繼續(xù)設計引物。此時，需記下跨內含子引物所在2個外顯子的位置（確認是否在CDS序列內）。3）、打開PrimerPremier5，點擊File-New-DNAsequence,出現(xiàn)輸入序列窗口，Cop
4、y步驟1的CDNA序列在輸入框內（選擇As），[此窗口內，序列也可以直接翻譯成蛋白]。點擊Primer，進入引物窗口。4）、此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結果”選項，點擊Search按鈕，進入引物搜索框，選擇“PCRprimers”——“Pairs”，設定搜索區(qū)域、引物長度和產(chǎn)物長度。搜索區(qū)域即為上一步記下的兩外顯子序列位置，QPCR引物長度大約為15~20bp,產(chǎn)物長度為80~150bp.在SearchParameters里面，可以設定相應參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認即可。5）、點擊OK，軟件即開始自動搜索引物，搜索完
5、成后，會自動跳出結果窗口，搜索結果默認按照評分（Rating）排序，點擊其中任一個搜索結果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。6）、對于引物的序列，可以簡單查看一下，Tm應該在55～70度之間，GC％應該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結構信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結構，點擊該紅色按鈕，即可看到相應二級結構位置圖示。最理想的引物，應該都不
6、存在這些二級結構，即這幾個按鈕都顯示為“None”為好。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否會明顯影響產(chǎn)物。對于引物具體詳細的評價需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質量感覺不如Primer5.7）、在Primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結果窗口中，點擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Currentpair，使用PDF虛擬打印機，即可轉換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細信息。4、用PRIME
7、R5查找已知引物的在DNA序列內的產(chǎn)物位置，確定其是否跨內含子步驟：打開PRIMER5，將DNA序列貼入，點擊primer，顯示primerprimer界面，點擊左上方的“S”，再點擊EDITprimer，顯示EDITprimer界面，在“5‘-3‘”框中貼入上一步確定的Forwardprimer，點擊asis，顯示序列已被貼入，點擊analyze，再點擊primer，顯示輸入的序列和已知DNA良好配對，點擊OK。顯示“primerprimer界面”，點擊左上方的“A”，再點擊EDITprimer，顯示EDITprimer界面，在“3‘-5‘”框中貼
8、入已知的REVERSEprimer，點擊REVERSE，顯示序列已被貼入，點擊analyze，再點擊prim
