設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物的方法.docx

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1、設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物的方法一、為什么要設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物區(qū)別或消除gDNA的擴(kuò)增二、如何設(shè)計(jì)1、在pubmed上找到目標(biāo)基因的DNA序列以及其內(nèi)含子和外顯子情況步驟：打開NCBI主頁(yè)面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，links到geneback即可顯示出該基因DNA的信息,這是基因組DNA,從mRNA選項(xiàng)中JION后面的是外顯子的位置，為了以后的操作，可以把這個(gè)DNA序列、外顯子和CDS序列的起至位置記下來。2、在pubmed上找到目標(biāo)基因的mRNA序列步驟：打開NCBI主頁(yè)面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，點(diǎn)擊進(jìn)入基因頁(yè)

2、面，即可顯示出這個(gè)基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它記下來。注：最好能找到以NM或XM開頭的序列，以此做為設(shè)計(jì)引物的模板。NCBIRefSeq(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心參考序列庫(kù))是目前世界上最完整和最具有權(quán)威性的人類基因組編碼mRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)。它已收集了大約17,500個(gè)經(jīng)cDNA測(cè)序證實(shí)的"NM"序列，還有大約10,000個(gè)主要由計(jì)算機(jī)推測(cè)產(chǎn)生的"XM"序列。由于一些序列來自異常連接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物或由計(jì)算機(jī)推演產(chǎn)生的不正確內(nèi)含子-外顯子剪切，因此該數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的參考序列一直在不斷地被修改中，盡管如此，NCBIRefSeq仍

3、是目前最可信賴的人類基因mRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)。3、如何設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物（利用primer5）步驟：1）、在第2步頁(yè)面右邊，點(diǎn)擊realtimePCR一般產(chǎn)物長(zhǎng)度為80～150bp，引物長(zhǎng)度15~20bp，點(diǎn)擊GETprimer。2）、會(huì)得到若干條引物，從圖中信息即可看出跨內(nèi)含子的引物，建議只用BLST找到跨內(nèi)含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer5繼續(xù)設(shè)計(jì)引物。此時(shí)，需記下跨內(nèi)含子引物所在2個(gè)外顯子的位置（確認(rèn)是否在CDS序列內(nèi)）。3）、打開PrimerPremier5，點(diǎn)擊File-New-DNAsequence,出現(xiàn)輸入序列窗口，Cop

4、y步驟1的CDNA序列在輸入框內(nèi)（選擇As），[此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白]。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。4）、此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCRprimers”——“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域、引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。搜索區(qū)域即為上一步記下的兩外顯子序列位置，QPCR引物長(zhǎng)度大約為15~20bp,產(chǎn)物長(zhǎng)度為80~150bp.在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可。5）、點(diǎn)擊OK，軟件即開始自動(dòng)搜索引物，搜索完

5、成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。6）、對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，Tm應(yīng)該在55～70度之間，GC％應(yīng)該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不

6、存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5.7）、在Primer5窗口中，若覺得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Currentpair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。4、用PRIME

7、R5查找已知引物的在DNA序列內(nèi)的產(chǎn)物位置，確定其是否跨內(nèi)含子步驟：打開PRIMER5，將DNA序列貼入，點(diǎn)擊primer，顯示primerprimer界面，點(diǎn)擊左上方的“S”，再點(diǎn)擊EDITprimer，顯示EDITprimer界面，在“5‘-3‘”框中貼入上一步確定的Forwardprimer，點(diǎn)擊asis，顯示序列已被貼入，點(diǎn)擊analyze，再點(diǎn)擊primer，顯示輸入的序列和已知DNA良好配對(duì)，點(diǎn)擊OK。顯示“primerprimer界面”，點(diǎn)擊左上方的“A”，再點(diǎn)擊EDITprimer，顯示EDITprimer界面，在“3‘-5‘”框中貼

8、入已知的REVERSEprimer，點(diǎn)擊REVERSE，顯示序列已被貼入，點(diǎn)擊analyze，再點(diǎn)擊prim