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1、淀粉酶活力的測定一、目的學(xué)習(xí)和掌握測定淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)活力的原理和方法。二、原理淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種。α-淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3
2、,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其反應(yīng)如下:淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于幾乎所有植物中，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子，淀粉酶活力最強(qiáng)，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。β-淀粉酶不耐熱，在70?15min鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測定活力時鈍化其中之一，就可測出另一種淀
3、粉酶的活力。本實(shí)驗采用加熱的方法鈍化β-淀粉酶，測出α-淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力)，再減去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。三、實(shí)驗材料、主要儀器和試劑1(實(shí)驗材料萌發(fā)的小麥種子(芽長約1cm)2(儀器(1)離心機(jī)(2)離心管(3)研缽(4)電爐(5)容量瓶:50mL×1,100mL×1(6)恒溫水浴(7)20mL具塞刻度試管×13(8)試管架(9)刻度吸管:2mL×3,1mL×2,10mL×1(10)分光光度計3(試劑(均為分析純)(1)標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液(1m
4、g/mL):精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。(2)3,5-二硝基水楊酸試劑:精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2(3)0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液A液:(0.1mol/L檸檬酸):稱取CHO?HO21.01，g用蒸餾水溶解并定6872容至1L。B液:(0.1mol/L檸檬酸鈉):稱取NaCHO?2HO29.41，g用蒸餾
5、水溶解36572并定容至1L。取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。(4)1%淀粉溶液:稱取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。四、操作步驟1(麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表1加入試劑:管號試劑1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)00.20.61.01.41.82.0蒸餾水(mL)2.01.81.41.00.60.20麥芽糖含量(mg)00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水楊酸(mL)2.02.02.02.0
6、2.02.02.0搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長下比色測定光密度。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2(淀粉酶液的制備稱取1g萌發(fā)3天的小麥種子(芽長約1cm)，置于研缽中，加入少量石英砂和2mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15,20min，每隔數(shù)分鐘攪動1次，使其充分提取。然后在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸餾
7、水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力測定。吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測定。2(酶活力的測定:取6支干凈的試管，編號，按表2進(jìn)行操作。酶活力測定取樣表操作項目α-淀粉酶活力測定β-淀粉酶活力測定?-1?-2?-3?-4?-5?-6淀粉酶原液(mL)1.01.01.0000鈍化β-淀粉酶置70?水浴15min，冷卻淀粉酶稀釋液(mL)0001.01.01.03,5-二硝基水楊酸(mL)2.0002.00.0預(yù)保溫將各試管和
8、淀粉溶液置于40?恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液(mL)1.01.01.01.01.01.0保溫在40?恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min3,5-二硝基水楊酸(mL)02.02.002.02.0將各試管搖勻，顯色后進(jìn)行比色測定光密度，記錄測定結(jié)果，操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。五、結(jié)果計算計算?-2、?-3光密度平均值與?-1光密度
